一種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑及其制備方法技術(shù)

一種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，包括蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇，其中蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇的摩爾比為：10～25∶50～70∶1～15∶5～25，優(yōu)選為15～20∶55～65∶5～10∶10～20，更優(yōu)選為17∶60∶8∶15。其通過(guò)先制備納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，再采用異型雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)法進(jìn)行IL-8單克隆抗體與自制納米級(jí)脂質(zhì)體的偶聯(lián)，從而制備得出靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑。為靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體造影技術(shù)早期診斷和治療與IL-8高表達(dá)相關(guān)疾病提供方法學(xué)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專(zhuān)利摘要】一種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，包括蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇，其中蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇的摩爾比為：10～25∶50～70∶1～15∶5～25，優(yōu)選為15～20∶55～65∶5～10∶10～20，更優(yōu)選為17∶60∶8∶15。其通過(guò)先制備納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，再采用異型雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)法進(jìn)行IL-8單克隆抗體與自制納米級(jí)脂質(zhì)體的偶聯(lián)，從而制備得出靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑。為靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體造影技術(shù)早期診斷和治療與IL-8高表達(dá)相關(guān)疾病提供方法學(xué)和物質(zhì)基礎(chǔ)?！緦?zhuān)利說(shuō)明】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于納米材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑及 其制備方法。
技術(shù)介紹
近年來(lái)隨著超聲造影劑制作工藝的優(yōu)化和分子化學(xué)的發(fā)展，超聲造影劑的制備已 經(jīng)走入了一個(gè)多樣化的時(shí)代。就目前制備超聲造影劑的膜材料來(lái)說(shuō)，可分為非離子表面活 性劑類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)和高分子多聚體類(lèi)，其中脂質(zhì)類(lèi)是目前較為常用的膜材料，相國(guó) 內(nèi)外的研究已經(jīng)證實(shí)脂質(zhì)是一類(lèi)穩(wěn)定的膜材料，而且脂膜的彈性好、變形性好，一方面比起 白蛋白膜來(lái)說(shuō)，具有更好的穩(wěn)定性及回聲特性；另一方面在聲場(chǎng)作用下，微泡能夠有規(guī)律的 膨大和縮小，此外，在超聲輻射力的驅(qū)動(dòng)下微泡在血液中的流動(dòng)緩慢、相互吸引并向管壁移 動(dòng)，可使更多大于管壁孔徑、具有更大回聲特性的微泡透過(guò)血管壁。 根據(jù)造影劑的大小可將造影劑分為微米級(jí)造影劑和納米級(jí)造影劑，一般來(lái)說(shuō)，我 們通過(guò)激光掃描法、電子顯微鏡法、庫(kù)爾特粒度分析法來(lái)分析造影劑微粒的大小。微米級(jí)造 影劑因其內(nèi)徑較大，不能透過(guò)血管，屬于血池顯像，限制了其對(duì)血管外疾病的診斷和治療。 納米級(jí)造影劑是指顆粒直徑在納米尺度范圍內(nèi)的造影劑，粒徑小于l〇〇〇nm(l μ m)。納米級(jí) 造影劑較常規(guī)造影劑有極強(qiáng)的穿透力，可以通過(guò)血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入組織間隙，使血管外靶 組織顯像成為可能，從而超越常規(guī)造影劑僅能發(fā)生血池內(nèi)顯像的局限性，推動(dòng)超聲分子顯 像與靶向治療向血管外領(lǐng)域拓展。Oeffinger等證實(shí)納米級(jí)微泡超聲造影劑用于超聲造影 增強(qiáng)是完全可行的。此外，物質(zhì)的尺寸減少到納米級(jí)后，分子特性會(huì)發(fā)生很大改變，表現(xiàn)出 許多特有的性質(zhì)，如表面積大、表面活性中心多、表面反應(yīng)活性高、強(qiáng)烈的吸附能力以及不 易受體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)各種酶的降解等，這都為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究應(yīng)用中開(kāi)辟了新的道 路，但因其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、反射性及封包率等問(wèn)題，目前仍在實(shí)驗(yàn)階段。 脂質(zhì)體作為造影劑時(shí)，經(jīng)靜脈注射進(jìn)入人體后，易先被富含網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的組織， 如肝、脾及骨髓等所攝取，即脂質(zhì)體具有一定的靶向性，但這屬于被動(dòng)靶向，其特異性和靶 向性均較差，無(wú)法滿(mǎn)足靶向性超聲造影技術(shù)的要求。通常，我們會(huì)通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行一些 特殊處理，在其表面裝配具有靶向性的配體（如單克隆抗體）來(lái)實(shí)現(xiàn)的脂質(zhì)體造影劑在體 內(nèi)的高特異性和靶向性。本專(zhuān)利技術(shù)用不同脂類(lèi)作為膜材料，使用冷凍干燥-超聲法成功制備 了納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，并使用異型雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)法成功將IL-8單克隆抗體偶 聯(lián)于自制納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑上，為靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體造影技術(shù)早期診斷和治療與 IL-8高表達(dá)相關(guān)疾病提供方法學(xué)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)旨在提供一種可以靶向顯影，用于疾病早起診斷和治療的納米級(jí)超聲造影 齊U，同時(shí)還提供了其制備方法。 本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： -種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，包括蛋黃卵磷脂（EPC)、二硬脂酰磷脂酰膽 堿（DSPC)、棕櫚酸和膽固醇（CH)，其中蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇 的摩爾比為：1〇?25 : 50?70 : 1?15 : 5?25,優(yōu)選的，蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂 酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇的摩爾比為：15?20 : 55?65 : 5?10 : 10?20,最優(yōu)選的 蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇的摩爾比為17 : 60 : 8 : 15。 -種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑的制備方法，包括以下步驟：1)納米級(jí)脂質(zhì) 體超聲造影劑，2)靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑的制備。 所述的步驟1具體為： a.按照比例稱(chēng)取蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇和棕櫚酸混合放置于 試管中； b.向上述混合物中加入氯仿溶液，混合物與氯仿溶液的質(zhì)量體積比為lml/mg，使 用漩渦混合器振動(dòng)Imin后使其完全溶解，將此混合液放入-80°C冰箱冷凍36h。 c.將冷凍成固體的脂質(zhì)體混合物放入凍干機(jī)中真空干燥處理6h，去除三氯甲烷， 成均勻穩(wěn)定的脂質(zhì)膜。 d.在所得脂質(zhì)膜中加入一定量的去離子水（lOml/mg)，然后將其放入溫育箱中溫 育30min使脂質(zhì)膜充分溶解于去離子水中，用超聲波破碎儀對(duì)此混懸液進(jìn)行超聲處理。 e.等體積甘露醇混入脂質(zhì)體混懸液中，用_196°C液氮將其速凍成固體，然后放入 凍干機(jī)中凍干24h形成脂質(zhì)微粒凍干粉，以備下一步使用。 f.將脂質(zhì)體凍干粉中加入磷酸緩沖液，震蕩搖勻既得納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑 所述的步驟2具體為： a.取適量的鼠抗人IL-8單克隆抗體，溶于pH7. 4的磷酸緩沖溶液中，加入異型雙 功能交聯(lián)劑溶液，置于4°C冰箱中反應(yīng)60min進(jìn)行反應(yīng)； b.將反應(yīng)混合物加入離心管中離心洗滌去除剩余異型雙功能交聯(lián)劑，在得到的帶 批陡二硫基的單克隆抗體帶批陡二硫基的單克隆抗體溶液中加入過(guò)量的二硫蘇糖醇（DTT) 醋酸溶液，置于4°C冰箱中反應(yīng)30min后再次離心洗滌以除去剩余的二硫蘇糖醇（DTT)，最 后得到帶巰基的抗體溶液。 C.取適量步驟（1)中自制的納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑懸液，加入適量異型雙功能 交聯(lián)劑溶液，置于4°C冰箱反應(yīng)60min，pH7. 4磷酸鹽緩沖溶液洗滌，得到帶吡啶二硫基的微 泡懸液，立即與人帶巰基的抗體溶液混合，反應(yīng)后經(jīng)PH7. 4磷酸緩沖液再次洗滌，最終得到 與IL-8單克隆抗體偶聯(lián)的納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑。 d.所述的磷酸緩沖溶液以1 : 15(容積比）的比例加入20mmol/L的異型雙功能 交聯(lián)劑溶液。 本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果為采用不同的脂質(zhì)體做為膜材料，成功制備了納米級(jí)脂質(zhì)體超 聲造影劑，使用異型雙功能交聯(lián)劑成功將IL-8單克隆抗體偶聯(lián)于自制納米級(jí)脂質(zhì)體超聲 造影劑上，為靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體造影技術(shù)早期診斷和治療與IL-8高表達(dá)相關(guān)疾病提供 方法學(xué)和物質(zhì)基礎(chǔ)。 【專(zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】 圖1是膽固醇含量脂質(zhì)體復(fù)水后靜置不同時(shí)間兔左心腔造影時(shí)超聲均值的比較； 圖2是膽固醇含量脂質(zhì)體復(fù)水后靜置不同時(shí)間行兔左心腔造影時(shí)峰值強(qiáng)度的比 較； 圖3是DSPC含量脂質(zhì)體復(fù)水后靜置不同時(shí)間行兔左心腔造影時(shí)超聲均值的比 較； 圖4是DSPC含量脂質(zhì)體復(fù)水后靜置不同時(shí)間行兔左心腔造影時(shí)峰值強(qiáng)度的比 較； 圖5是凍干前后脂質(zhì)體復(fù)水后靜置不同時(shí)間行兔左心腔造影時(shí)超聲均值的比較； 圖6是凍干前后脂質(zhì)體復(fù)水后靜置不同時(shí)間行兔左心腔造影時(shí)峰值強(qiáng)度的比較； 圖7是凍干前后脂質(zhì)體常溫下放置不同時(shí)間后再?gòu)?fù)水時(shí)行兔左心腔造影時(shí)超聲 均值的比較； 圖8是自制脂質(zhì)體與SonoVue微本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種靶向性納米級(jí)脂質(zhì)體超聲造影劑，包括蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇，其特征在于：所述的蛋黃卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰膽堿、棕櫚酸和膽固醇的摩爾比為：10～25∶50～70∶1～15∶5～25。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陸永萍，韋嘉，李云燕，徐麗榮，湯躍躍，黃燕玲，楊薇，張容亮，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：陸永萍，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：云南;53