蘇云金芽孢桿菌毒素基因AXMI335及其使用方法技術

在此提供了用于賦予針對細菌、植物、植物細胞、組織以及種子的殺有害生物活性的組合物和方法。提供了包括針對一種毒素多肽的一種編碼序列的組合物。這些編碼序列可以用在DNA構建體或表達盒中，以便用于在植物和細菌中轉化和表達。組合物還包括轉化的細菌、植物、植物細胞、組織、以及種子。具體地說，提供了分離的毒素核酸分子。另外，涵蓋了與這些多核苷酸相應的氨基酸序列、以及與這些氨基酸序列特異性結合的抗體。具體地說，本發明專利技術提供了分離的核酸分子，這些核酸分子包括編碼SEQ?ID?NO:2或4中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQ?ID?NO:1或3中列出的核苷酸序列、以及它們的變體和片段。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】蘇云金芽孢桿菌毒素基因AXMI335及其使用方法相關申請的交叉引用本申請要求2012年3月8日根據35U.S.C.§111(b)提交的美國臨時專利申請號61/608,303的優先權，該專利申請通過引用以其全文特此結合。專利
本專利技術涉及分子生物學領域。提供了編碼殺有害生物蛋白的新穎的基因。這些蛋白質和編碼它們的這些核酸序列在制備殺有害生物制劑中以及在生產轉基因抗有害生物植物中是有用的。專利技術背景蘇云金芽孢桿菌是革蘭氏陽性產芽孢土壤細菌，其特征在于其產生晶狀內含體的能力，所述晶狀內含體特異性地對于昆蟲的某些目和種具有毒性，但對于植物和其他非靶生物是無害的。因此，包括蘇云金芽孢桿菌菌株或它們的殺昆蟲蛋白質的組合物可用作環境上可接受的殺昆蟲劑以用于控制農業昆蟲有害生物或者各種人或動物疾病的昆蟲媒介。來自蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ-內毒素)具有主要針對鱗翅目、半翅目、雙翅目、以及鞘翅目幼蟲的有效的殺昆蟲活性。這些蛋白還已經顯示針對膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及蜱螨亞綱有害生物目(Acaripestorder)、連同其他無脊椎動物目(如線蟲動物門、扁形動物門、以及原生動物門肉鞭毛蟲亞門)的活性(費特遜(Feitelson)(1993)蘇云金芽孢桿菌家族樹(TheBacillusThuringiensisfamilytree)。先進的工程殺有害生物劑(AdvancedEngineeredPesticides)，馬塞爾穧德克爾格式(MarcelDekker,Inc.)，紐約，紐約州(N.Y.))。這些蛋白質最初主要基于它們的殺昆蟲活性而分類為CryI至CryV。這些主要的類別是鱗翅類特異的(I)、鱗翅類與雙翅目特異的(II)、鞘翅目特異的(III)、雙翅目特異的(IV)、以及線蟲特異的(V)與(VI)。這些蛋白質進一步分類成亞家族；在每個家族內更高度相關的蛋白質被指定了分組字母例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等等。在每個分組內更加密切相關的蛋白質被給予諸如Cry1C1、Cry1C2等的名稱。最近基于氨基酸序列同源性而不是昆蟲靶特異性描述了Cry基因的新命名法(克里克莫爾(Crickmore)等人(1998)微生物學與分子生物學評論(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。在該新的分類中，每種毒素被指定了獨特的名稱，其中包括第一級(primaryrank)(阿拉伯數字)、第二級(secondaryrank)(大寫字母)、第三級(tertiaryrank)(小寫字母)、以及第四級(quaternaryrank)(另一個阿拉伯數字)。在該新的分類中，在第一級中，羅馬數字已被換成阿拉伯數字。具有低于45％的序列一致性的蛋白質具有不同的第一級，第二和第三級的標準分別為78％和95％。晶體蛋白不展示殺昆蟲活性，直至其被攝取并溶解在昆蟲中腸之中。被攝取的原毒素在昆蟲消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(和懷特利(Whiteley)(1989)微生物學評論(Microbiol.Rev.)53:242-255)。這種毒素與靶幼蟲的中腸中的頂端刷狀緣受體結合并插入頂端膜中，產生離子通道或孔，從而導致幼蟲死亡。δ-內毒素通常具有五個保守的序列結構域和三個保守的結構性結構域(參見，例如戴馬格德(deMaagd)等人(2001)遺傳學趨勢17:193-199)。第一個保守的結構性結構域由7個α螺旋組成并且參與膜插入和孔形成。結構域II由排列成希臘鑰匙構型的三個β片層組成并且結構域III由“果凍卷”結構中的兩個反向平行的β片層組成(deMaagd等人，2001，上文)。結構域II和III參與受體識別和結合，并且因此被認為是毒素特異性的決定簇。除了δ-內毒素之外，存在若干其他已知類別的殺有害生物蛋白毒素。這些VIP1/VIP2毒素(參見例如美國專利5,770,696)是二元殺有害生物毒素，它們通過一種機制對昆蟲表現強活性，該機制被認為涉及受體介導的胞吞隨后細胞毒化，類似于其他二元(“A/B”)毒素的作用方式。A/B毒素，例如VIP、C2、CDT、CST，或炭疽芽孢桿菌水腫和致命毒素，最初通過“B”組分(作為單體)的一種特異的受體介導的結合與靶細胞相互作用。然后這些單體形成同七聚物(homoheptamer)。然后該“B”七聚物-受體復合物充當對接平臺，隨后該平臺約束并允許酶的一種或多種“A”組分通過受體介導的胞吞而易位到細胞溶質中。一旦到細胞的細胞溶質內部，“A”組分通過例如G-肌動蛋白的ADP-核糖基化或增加環狀AMP(cAMP)的細胞內水平而抑制正常細胞功能。參見巴斯(Barth)等人(2004)微生物學與分子生物學評論(MicrobiolMolBiolRev)68:373-402。大量使用基于蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲劑已經引起菱形斑蛾——小菜蛾的田間種群的抗性(費亥(Ferré)和范里(VanRie)(2002)昆蟲學年評(Annu.Rev.Entomol.)47:501-533)。最常見的抗性機制是該毒素與其一種或多種特異性中腸受體的結合的減少。這還可以賦予針對共享相同受體的其他毒素的交叉抗性(費亥(Ferré)和范里(VanRie)(2002))。專利技術概述在此提供了用于賦予針對細菌、植物、植物細胞、組織以及種子的殺有害生物活性的組合物和方法。組合物包括針對殺有害生物的和殺昆蟲的多肽的核酸分子編碼序列、包括那些核酸分子的載體、以及包括這些載體的宿主細胞。組合物還包括這些殺有害生物多肽序列以及針對那些多肽的抗體。這些核苷酸序列可以用在DNA構建體或表達盒中，以用于在多種生物(包括微生物和植物)中進行轉化和表達。這些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，這些合成序列已經被設計為用于在一種生物中表達，該生物包括但不局限于：一種微生物或一種植物。組合物還包括含有本專利技術的核苷酸序列的細菌、植物、植物細胞、組織、以及種子。具體地說，提供了編碼一種殺有害生物蛋白的分離的或重組的核酸分子。另外，涵蓋了與這些殺有害生物蛋白相應的氨基酸序列。具體地，本專利技術提供了一種分離或重組的核酸分子，該核酸分子包括編碼SEQIDNO:2或4中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQIDNO:1或3中列出的核苷酸序列、以及它們的生物活性變體和片段。還涵蓋了與本專利技術的一個核苷酸序列互補的核苷酸序列、或與本專利技術的一個序列或其互補物雜交的核苷酸序列。另外還提供了包括本專利技術的這些核苷酸序列或者編碼本專利技術的這些氨基酸序列的核苷酸序列以及它們的生物活性變體和片段的載體、宿主細胞、植物以及種子。提供了用于產生本專利技術的多肽的方法、以及用于使用這些多肽來控制或殺死鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線蟲、或雙翅目有害生物的方法。還包括用于檢測在樣品中的本專利技術的這些核酸和多肽的方法和試劑盒。本專利技術的這些組合物和方法用于產生具有增強的有害生物抗性或耐受性的生物，特別是細菌和植物。這些生物以及包括這些生物的組合物對于農業目的是所希望的。本專利技術的這些組合物還用于產生具有殺有害生物活性的改變的或改進的蛋白質、或檢測在產物或生物中的殺有害生物蛋白或核酸的存在。詳細說明本專利技術描繪了用于調節生物(特別是植物或植物細胞)中的有害生物抗性或耐受性的組合物和方法本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組核酸分子，該重組核酸分子包括一個核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一個具有殺有害生物活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列選自下組，該組由以下各項組成：a)在SEQ?ID?NO:1或3中列出的核苷酸序列；b)一個核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種多肽，該多肽包括SEQ?ID?NO:2或4的氨基酸序列；c)一個核苷酸序列，該核苷酸序列編碼了包括一個氨基酸序列的一種多肽，該氨基酸序列具有與SEQ?ID?NO:2或4的氨基酸序列至少95％的序列一致性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.03.08 US 61/608,3031.一種重組核酸分子，該重組核酸分子由核苷酸序列構成，該核苷酸序列編碼具有殺有害生物活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列選自：a)在SEQIDNO：1或3中列出的核苷酸序列；以及b)編碼以下多肽的核苷酸序列，該多肽由SEQIDNO：2或4的氨基酸序列構成。2.如權利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是已經被設計為用于在植物中表達的合成序列。3.如權利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列被可操作地連接至能夠指導所述核苷酸序列在植物細胞中表達的啟動子。4.一種載體，其包括如權利要求1所述的重組核酸分子。5.如權利要求4所述的載體，該載體進一步包括編碼異源多肽的核酸分子。6.一種宿主細胞，其包括如權利要求1所述的重組核酸。7.如權利要求6所述的宿主細胞，該宿主細胞是細菌宿主細胞。8.一種具有殺有害生物活性的重組多肽，該多肽由SEQIDNO：2或4的氨基酸序列構成。9.如權利要求8所述的多肽，該多肽進一步包括異源氨基酸序列。10.一種組合物，包括如權利要求8所述的多肽。11.如權利要求10所述的組合物，其中所述組合物選自粉劑、小丸、顆粒、噴霧劑、乳液、膠體、以及溶液。12.如權利要求10所述的組合物，其中所述組合物通過將細菌細胞的培養物進行干燥、均質化、提取、過濾、離心、沉降、或濃縮而制備。13.如權利要求10所述的組合物，該組合物包括按重量計為1％至9...

【專利技術屬性】
技術研發人員：金柏莉·S·桑普森，麗貝卡·賽耶，杜安·萊赫蒂寧，
申請(專利權)人：阿森尼克斯公司，
類型：發明
國別省市：美國;US