毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法技術

本發明專利技術涉及一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，屬于生物分離分析技術領域。所述方法如下：對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣順序先后依次為：毛細管中遷移速率慢的反應物，電泳緩沖溶液，毛細管中遷移速率快的反應物，使遷移速率不同的反應物在所述電泳過程的毛細管中實現在線反應混和后完成電泳，分離收集電泳產物，對所述產物進行毛細管電泳-激光誘導熒光檢測；所述反應物為蛋白質和ssDNA。所述方法中兩種反應物在毛細管電泳過程中完成在線混合及反應，不需孵育；復合物通過在線分離，快速簡便；所述方法高效，快速，且樣品用量少，利用率高，尤其適用于來源困難，價格昂貴的蛋白質。

【技術實現步驟摘要】
毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法
本專利技術涉及一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，屬于生物分離分析

技術介紹
單鏈寡核苷酸(single-strandedDNA,ssDNA)或RNA具有特定二級結構，可以與蛋白質分子形成高親和性和特異性的復合物。寡核苷酸文庫是一類含有1013～1015種不同堿基的單鏈DNA分子(ssDNA)混合物，其中可能含有一種或數種能與靶分子具有高特異性，高親和性結合的ssDNA，即核酸適配體(Aptamer)。核酸適配體是通過指數富集配體系統進化(SELEX)技術，從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的，具有與靶分子高親和性和高特異性的寡核苷酸序列配體，其特性是親和力高、特異性強、易制備及修飾，并且靶分子分布廣。由于在生物，醫藥以及分子識別和檢測方面有重要的應用價值，目前已經發展出多種核酸適配體的篩選方法，如親和色譜，膜過濾，磁珠分離及毛細管電泳等。毛細管電泳(CE)具有高效、快速以及實驗成本低等優點，是新型的微量分離分析技術，在蛋白質的核酸適配體篩選中有廣泛的應用。CE用于SELEX篩選核酸適配體即為CE-SELEX。CE-SELEX可使核酸適配體篩選周期縮短至傳統SELEX技術的三分之一，大大加快了篩選效率。由于傳統的CE-SELEX技術中，需將初始的ssDNA文庫與靶分子混合孵育，并需要對孵育的溫度、時間以及ssDNA文庫與靶分子的比例做一系列優化，使操作復雜、耗時且樣品耗費大。
技術實現思路
針對傳統的CE-SELEX技術篩選適配體時，靶分子用量大、反應條件優化過程繁瑣以及耗時費力的缺陷，本專利技術的目的在于提供一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，所述方法基于毛細管電泳的在線反應及分離方法，用于靶分子核酸適配體的高效篩選。為實現本專利技術的目的，采用的技術方案如下。一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，所述在線反應為本領域常用術語，是指在毛細管區帶電泳時毛細管中的反應，所述方法步驟如下：對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣順序先后依次為：毛細管中遷移速率慢的反應物，電泳緩沖溶液，毛細管中遷移速率快的反應物，使遷移速率不同的反應物在所述電泳過程的毛細管中實現在線反應混和后完成電泳，分離收集電泳產物，對所述產物進行毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)檢測；所述反應物為蛋白質和ssDNA，根據本領域毛細管區帶電泳的要求制成樣品溶液后進樣。優選在電泳緩沖液中加入反應物之一，可抑制復合物在所述電泳過程中解離，進而促進較弱復合物的形成。其中，所述毛細管中的遷移速率可通過分別對反應物，即蛋白質和ssDNA進行毛細管區帶電泳，根據所述反應物的出峰時間確定，先出峰的反應物遷移速率快。通過改變所述反應物的進樣時間，即進樣量，可獲得不同反應物的最佳進樣量比例。所述反應物可通過以下方法制成樣品溶液進樣：將蛋白質溶于純水中制成原始蛋白質儲備液，將ssDNA溶于純水中制備成原始ssDNA儲備液；將原始蛋白質儲備液稀釋后得到蛋白質樣品溶液，將原始ssDNA儲備液稀釋后得到ssDNA樣品溶液。優選確定反應物在毛細管中的遷移速率時的毛細管區帶電泳使用涂層毛細管，可抑制蛋白質在管壁的吸附，可采用總長度48.5cm，有效長度40cm，內徑75μm的毛細管；可使用Agilent7100毛細管電泳儀進行所述電泳；電泳緩沖液可為硼酸硼砂溶液，可通過將50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值為8.7；進樣條件可為：50mbar下，進樣3s～25s，分析條件可為：分析溫度25℃，分析電壓-15kV；可使用UV195nm進行檢測。優選反應物在毛細管區帶電泳在線反應時所使用的毛細管為涂層毛細管，可抑制蛋白質在管壁的吸附，可采用總長度為50.2cm，有效長度為40cm，內徑為75μm的涂層毛細管；可采用BeckmanP/ACEMDQ毛細管電泳儀進行所述電泳；電泳緩沖液與確定反應物在毛細管中的遷移速率時的毛細管區帶電泳使用的電泳緩沖液相同，可采用硼酸硼砂溶液，可通過50mM的硼砂溶液與20mM的硼酸溶液按體積比為3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值為8.7；進樣條件可為：蛋白質進樣：0.5psi，20s；電泳緩沖液進樣：0.5psi，10s；ssDNA進樣：0.5psi，10s；分析條件可為：分析溫度為25℃，分析電壓為-15kV；可采用的毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)檢測條件為：激發波長488nm，發射波長520nm。有益效果1.本專利技術提供了一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，首先進樣遷移速率慢的反應物，中間進樣電泳緩沖液隔離，然后進樣遷移速率快的反應物，可避免兩種反應物提前混合，確保兩種反應物在電泳分離開始后進行在線反應，在毛細管電泳過程中，遷移速率快的反應物會“穿越”遷移速率慢的反應物區域，并在“穿越”過程中伴隨復合物的形成和解離過程；由于所述方法是將反應物在毛細管內進行在線反應，因此對反應物需求量很少，且所有反應物都在線參與反應，該方法尤其適用于來源困難，價格昂貴的靶標反應物；2.本專利技術提供了一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，在所述電泳過程中，由于兩種反應物是在毛細管中在線反應，省去孵育步驟，避免繁瑣操作；3.本專利技術提供了一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，在所述電泳過程中，在電泳緩沖液中分別加入兩種反應物之一形成背景緩沖液，可抑制復合物在毛細管中在線反應時解離，進而促進較弱復合物的形成；通過增加反應物的進樣量可使復合物量增大，有益于收集得到較多的復合物；4.本專利技術提供了一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，在所述電泳分離過程中，遷移速率快、慢的反應物以及反應形成的復合物根據其荷質比大小，依次通過毛細管末端的檢測窗口，根據復合物的遷移時間，計算出復合物遷移至毛細管出口端的時間，進而可在毛細管出口端收集復合物；5.本專利技術提供了一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，由于所述反應物在線進行反應，分離速度快，操作簡便，有益于兩種反應物的反應條件優化。附圖說明圖1為實施例1中毛細管區帶電泳DAD檢測器檢測結果圖。圖2為實施例2中毛細管區帶電泳LIF檢測器檢測結果圖。圖3為實施例3中毛細管區帶電泳LIF檢測器檢測結果圖。圖4為實施例4中毛細管區帶電泳LIF檢測器檢測結果圖。圖5為實施例5中電泳緩沖液為Apt15-FAM背景緩沖液時，毛細管區帶電泳LIF檢測器檢測結果圖。圖6為實施例5中電泳緩沖液為H-Thr背景緩沖液時，毛細管區帶電泳LIF檢測器檢測結果圖。圖7為實施例6中毛細管區帶電泳LIF檢測器檢測結果圖。具體實施方式為了充分說明本專利技術的特性以及實施本專利技術的方式，下面給出實施例。以下實施例1中，15堿基H-Thr適配體(Apt15)序列：5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3'，29堿基H-Thr適配體(Apt29)序列：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'，以上適配體均購自生工生物工程(上海)有限公司；實施例2～7中，熒光標記15堿基H-Thr適配體(Apt15-FAM)序列：5'-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質?寡核酸復合物的方法，其特征在于：所述方法步驟如下：對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣順序先后依次為：毛細管中遷移速率慢的反應物，電泳緩沖溶液，毛細管中遷移速率快的反應物，使遷移速率不同的反應物在所述電泳過程的毛細管中實現在線反應混和后完成電泳，分離收集電泳產物，對所述產物進行毛細管電泳?激光誘導熒光檢測；所述反應物為蛋白質和ssDNA。

【技術特征摘要】
1.一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，其特征在于：所述方法步驟如下：對反應物進行毛細管區帶電泳，進樣順序先后依次為：毛細管中遷移速率慢的反應物，電泳緩沖溶液，毛細管中遷移速率快的反應物，使遷移速率不同的反應物在所述電泳過程的毛細管中實現在線反應混和后完成電泳，分離收集電泳產物，對所述產物進行毛細管電泳-激光誘導熒光檢測；所述反應物為蛋白質和ssDNA。2.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，其特征在于：在電泳緩沖液中加入反應物之一。3.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，其特征在于：所述反應物在毛細管中的遷移速率通過分別對反應物進行毛細管區帶電泳，根據所述反應物的出峰時間確定，先出峰的反應物遷移速率快。4.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，其特征在于：所述反應物通過以下方法制成樣品溶液進樣：將蛋白質溶于純水中制成原始蛋白質儲備液，將ssDNA溶于純水中制備成原始ssDNA儲備液；將原始蛋白質儲備液稀釋后得到蛋白質樣品溶液，將原始ssDNA儲備液稀釋后得到ssDNA樣品溶液。5.根據權利要求1所述的一種毛細管電泳在線反應分離蛋白質-寡核酸復合物的方法，其特征在于：所述毛細管為涂層毛細管。6.根據權利要求1、2、4或5所述的一種毛細管...

【專利技術屬性】
技術研發人員：屈鋒，胡猷浩，吳景剛，趙新穎，
申請(專利權)人：北京理工大學，
類型：發明
國別省市：北京;11