聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯物的制備及純化方法技術

一種聚乙二醇-葡激酶突變體偶聯物的制備及純化方法。包括以下步驟：將表達葡激酶突變體Sak-E80C的工程菌接種誘導培養收集上清液；將上清液加入到陽離子交換層析柱中進行洗脫，收集洗脫組分；用Bradford法測定收集液中Sak-E80C的濃度，然后將Sak-E80C、羥基-馬來酰亞胺聚乙二醇在室溫下反應，修飾完成后，將修飾反應液加入陽離子交換層析柱中進行洗脫，收集相應組分；將收集液加入到凝膠過濾層析柱中，用緩沖液進行沖洗,分別收集兩個主要洗脫峰；將獲得的含有Sak-E80C-HPG的收集液加入到陰離子交換層柱中進行洗脫并收集相應組分，將含有Sak-E80C-HPG的收集液分裝，進行冷凍干燥。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種聚乙二醇?葡激酶突變體偶聯物的制備及純化方法，其特征在于包括以下步驟：（1）將表達葡激酶突變體Sak?E80C的工程菌接種于液體培養基中，37℃培養6h后，升溫至42℃誘導培養4h，然后，4℃、5000?rpm離心10?分鐘收菌，棄上清，用pH=5?6、含有0.01M?EDTA和0.01M二硫蘇糖醇的0.02M?NaAC?HAC緩沖液，懸浮菌體進行超聲破碎，破碎后4℃、12000?rpm高速離心20?min，收集上清液；（2）將上清液pH調至5.6，加入到SP?Sepharose?FF陽離子交換層析柱（2.7×30?cm）中，然后用pH=5?6、含有80?1000mM?NaCl和0.01M二硫蘇糖醇的10?50mM?NaAc?HAc緩沖液進行洗脫，分別收集洗脫組分，用SDS?PAGE電泳分析，以確定突變體葡激酶Sak?E80C所在的洗脫峰，從而確定含Sak?E80C的收集液；將含Sak?E80C的收集液加入到Sephadex?G?50凝膠過濾層析柱（3.8×100?cm）中，上樣量為凝膠體積的5%，然后用pH=5?6、含0.01M二硫蘇糖醇的10?50mM?NaAc?HAc緩沖液進行沖洗，收集相應組分，用SDS?PAGE電泳分析，以確定含Sak?E80C的收集液；（3）用Bradford?法測定收集液中Sak?E80C的濃度，然后按照摩爾比，Sak?E80C：羥基?馬來酰亞胺聚乙二醇?=1:（3?10），在室溫下，反應進行3?5小時，修飾完成后，用SDS?PAGE電泳和SEC?HPLC分析聚乙二醇?葡激酶偶聯物(HO?PEG?MAL?Sak?E80C；Sak?E80C?HPG)的產率；將修飾反應液加入SP?Sepharose?FF陽離子交換層析柱（2.6×25?cm）中，然后用pH=5?6、含有100?200mM?NaCl?的10?50mM?NaAc?HAc緩沖液進行洗脫，收集相應組分；????將SP?Sepharose?FF陽離子交換層析獲得的收集液加入到?Toyopearl?HW?50F凝膠過濾層析柱（2.6×100?cm）中，上樣量為凝膠體積的5%，然后用pH=8?9、10?50mM?Tris?HCl緩沖液進行沖洗,?分別收集兩個主要洗脫峰，用SDS?PAGE電泳顯示，其中一個洗脫峰主要成分為聚乙二醇?葡激酶偶聯物（HO?PEG?MAL??Sak?E80C?HPG；Sak?E80C?HPG），另一洗脫峰主要為未被修飾的Sak?E80C；?將含有Sak?E80C?HPG的收集液加入到?Q?Sepharose?FF陰離子交換層柱（1.5×15?cm）中，然后用pH=8?9、含有100?200mM?NaCl?的10?50?mM?Tris?HCl緩沖液進行洗脫，收集相應組分，用SDS?PAGE電泳分析，以確定含有Sak?E80C?HPG的收集液，最后將含有Sak?E80C?HPG的收集液分裝，進行冷凍干燥得到產品。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：賀進田，王柱，王改珍，
申請(專利權)人：河北師范大學，
類型：發明
國別省市：河北;13