一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，所述方法包括如下步驟：首先是PCR擴增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進行聚合反應(yīng)，進行擴增，生成含有dU的擴增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反應(yīng)：擴增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對量，并根據(jù)測定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。本發(fā)明專利技術(shù)方法無放射性污染，操作簡單便捷，靈敏度高，可以定量檢測，并且穩(wěn)定。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生化
，具體來說涉及一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法。
技術(shù)介紹
UDG酶，即尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNA?Glycocasylase）。UDG的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成有缺失堿基的DNA鏈，在堿性介質(zhì)以及高溫下會進一步水解斷裂，從而被消除。UDG是細胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)中一種重要的組分，在自然界廣泛存在，包括細菌、真核生物、人細胞中都有UDG酶表達。UDG在PCR防污染方面具有非常重要的作用。PCR反應(yīng)最常見，最重要的污染物是PCR擴增產(chǎn)物污染。因為PCR靈敏度非常高，可到單拷貝。因此如果即使痕量的擴增產(chǎn)物污染了模板，也會導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。目前常用的做法是在PCR反應(yīng)體系中加入UDG，并以dUTP取代dTTP，這樣PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加一步較低溫度的孵育步驟，UDG酶即可將反應(yīng)體系中可能存在的上一輪的含有U-DNA的擴增產(chǎn)物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴增，從而保證擴增結(jié)果的特異性，準確性。同時UDG酶被滅活,不會再降解新擴增的產(chǎn)物U-DNA。尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)活性測定通常采用20世紀80年代初建立的同位素法，其原理大致為：UDG可將同位素標記的尿嘧啶從DNA或寡核苷酸上切下．當(dāng)DNA或寡核苷酸用三氯醋酸沉淀時，切下的尿嘧啶仍然留在溶液中，用液閃計數(shù)。這種方法易產(chǎn)生放射性污染，且步驟多、周期長，難以實現(xiàn)高通量、自動化。專利技術(shù)內(nèi)容本專利技術(shù)的目的是建立一種簡便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)測活方法。本專利技術(shù)原理如圖1所示。具體來說，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先是PCR擴增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進行聚合反應(yīng)，進行擴增，生成含有dU的擴增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反應(yīng)：擴增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對量，并根據(jù)測定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。優(yōu)選地，雙鏈UDNA或單鏈DNA的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且雙鏈UDNA或單鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料，例如可在市面上商購獲得的picogreen染料。優(yōu)選地，所采用的雙鏈DNA模板是λDNA，以便建立標準測定方法。本專利技術(shù)的優(yōu)點：1.?無放射性污染；2.?操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實現(xiàn)高通量、自動化的活性測定。3.?靈敏度高，可以定量檢測UDG酶的活性，并且穩(wěn)定。附圖說明圖1是本專利技術(shù)測定方法的原理圖。圖2是本專利技術(shù)測定方法獲得的酶活-熒光曲線圖。具體實施方式本專利技術(shù)的目的是建立一種簡便、快速、非放射性的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)測活方法。本專利技術(shù)原理如圖1所示。如圖1所示，λDNA可以在dU/A/G/CTP存在的條件下被Taq酶聚合生成UDNA，UDG酶可以水解斷裂含有dU的UDNA中的尿嘧啶糖苷鍵，形成有大量缺失堿基的DNA鏈，picogreen染料不能結(jié)合這種產(chǎn)物，從而不能產(chǎn)生熒光；但是不經(jīng)過UDG酶作用的UDNA鏈，則還是保持UDNA雙鏈結(jié)構(gòu)，它可以被picogreen染料結(jié)合，產(chǎn)生熒光。UDG酶的活性在一定范圍內(nèi)與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比，因此其活性就可以用Picogreen熒光強度來進行測定。本專利技術(shù)的測定方法包含以下方面：1.?UDNA的制備引物F：5’-cggatcgccacactcacaacaat-3’;引物R：5’-aaaggccgggaaatacccagcc-3’;PCR模板：λ?DNA?PCR反應(yīng)：組分體積DDW至50μl10xTaq緩沖液5dU/A/G/CTP混合物1μl引物F(10μM)2μl引物R(10μM)2μlλDNA10ngTaq酶1UPCR產(chǎn)物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式純化。純化的PCR產(chǎn)物用A260測定濃度。2.UDG反應(yīng)：組分體積DDW至50μl10xTaq緩沖液5UDNA100ngUDG1mU-1024mU溫度時間25℃30分鐘4℃保持3.?picogreen熒光檢測：向反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.5?μl?picogreen染料（invitrogen?P11495）；用熒光酶標儀檢測，激發(fā)波長為480?nm，發(fā)射波長為520?nm。5.?標準曲線繪制及待測樣品酶活計算：標準品活力單位(mU)的log值為橫坐標，熒光強度為縱坐標，用GraphPad?Prism5做非線性回歸曲線。根據(jù)待測樣品熒光強度，軟件即可自動回算出待測樣品的酶活?(mU/μl)。下面將結(jié)合具體實施例來進一步說明本專利技術(shù)。實施例1.?熒光法測定UNG活性方法的建立1.?UDNA的制備引物F：5’-cggatcgccacactcacaacaat-3’;引物R：5’-aaaggccgggaaatacccagcc-3’;PCR模板：λ?DNAPCR反應(yīng)：組分體積DDW至50μl10xTaq緩沖液5dU/A/G/CTPmix1μl引物F(10μM)2μl引物R(10μM)2μlλDNA10ngTaq酶1UPCR產(chǎn)物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀的方式純化。純化的PCR產(chǎn)物用A260測定濃度。2.UDG反應(yīng)：UDG為NEBM0280L組分體積DDW至50μl10xTaq緩沖液5UDNA100ngUDG1mU-1024mU溫度時間25℃30分鐘4℃保持3.?picogreen熒光檢測：向反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.5?μl?picogreen染料（invitrogen?P11495）；用熒光酶標儀檢測，激發(fā)波長為480?nm，發(fā)射波長為520?nm。檢測結(jié)果如下表：UDG(mU)熒光數(shù)值102465.51265.25670.12896.64173.32372.16618.8856.4997.21063.11064.01067.這一結(jié)果表明，UDG酶可以水解斷裂含有dU的UDNA中的尿嘧啶糖苷鍵，且水解程度呈現(xiàn)劑量依賴性。以UDG活性單位(mU)的log值為橫坐標，熒光強度為縱坐標，用GraphPad?Prism5做非線性回歸曲線。我們發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)點可以很好地擬合出一條倒S型曲線，如圖2所示。通過多次重復(fù)實驗并計算曲線的半最大效應(yīng)濃度(EC50)，我們發(fā)現(xiàn)，EC50值在多次實驗間保持穩(wěn)定：實驗EC50(mU)118.25218.4本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種尿嘧啶?DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先是PCR擴增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進行聚合反應(yīng)，進行擴增，生成含有dU的擴增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶?DNA糖基化酶反應(yīng)：擴增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶?DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對量，并根據(jù)測定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶?DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶?DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。

【技術(shù)特征摘要】
1.?一種尿嘧啶-DNA糖基化酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：首先是PCR擴增反應(yīng)：以雙鏈DNA為模板，在dU/A/G/CTP混合物和引物存在下，利用聚合酶進行聚合反應(yīng)，進行擴增，生成含有dU的擴增產(chǎn)物UDNA雙鏈；其次是尿嘧啶-DNA糖基化酶反應(yīng)：擴增產(chǎn)物經(jīng)受尿嘧啶-DNA糖基化酶作用，形成大量堿基缺失的DNA鏈；最后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA產(chǎn)物或UDNA雙鏈的相對量，并根據(jù)測定結(jié)果推導(dǎo)出尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶活性程度與反應(yīng)體系中UDNA雙鏈的量成反比，而與單鏈DNA產(chǎn)物的量成正比。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐曉昱，劉來花，王靜，
申請(專利權(quán))人：南京諾唯贊生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32