用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法，用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒；包括非離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅱ、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑。本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒及使用該試劑盒的方法能夠在短時(shí)間內(nèi)能夠獲取多器官和組織的去細(xì)胞支架，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大部分結(jié)構(gòu)，從而再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究和運(yùn)用提供產(chǎn)品材料。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法
本專利技術(shù)涉及獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒，具體涉及用于去除不同器官和組織抗原成分的試劑盒。本專利技術(shù)還設(shè)計(jì)使用所述試劑盒獲得多器官和組織支架的方法。
技術(shù)介紹
近幾年去細(xì)胞組織工程發(fā)展迅速，目前多種組織來(lái)源的去細(xì)胞支架已成功運(yùn)用到在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中，如皮膚，血管，神經(jīng)，小腸粘膜下層以及肝臟等。除了上述較成熟的去細(xì)胞組織外，許多動(dòng)物的全器官去細(xì)胞支架也已成功制備，比如心臟，肝臟，腎臟，肺臟，脊髓等，在組織器官移植需求緊張的現(xiàn)狀下，為異體移植打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。但是每種全器官或組織去細(xì)胞支架的制備方法復(fù)雜多樣，所用的試劑也較為雜亂，缺乏系統(tǒng)的整理。程遠(yuǎn)等人公開(kāi)了一種制備肝臟去細(xì)胞的試劑盒及其使用方法，盡管上述試劑盒依次利用溶栓液、灌注液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ依次對(duì)肝臟進(jìn)行灌注能夠制得去細(xì)胞肝臟支架，但是其試劑盒只能應(yīng)用于制備部分動(dòng)物的肝臟的去細(xì)胞支架，而且步驟比較繁瑣，并且由于方法和試劑的較為單一無(wú)法滿足其他器官和組織去細(xì)胞的要求，因此應(yīng)用范圍過(guò)于狹?。徊窦铱频热斯_(kāi)了無(wú)細(xì)胞毒性去細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備及應(yīng)用，在不利用洗滌劑的前提下提供了效果良好的去細(xì)胞方案，然而最終檢測(cè)可看出DNA殘留量很大，因此抗原性的增強(qiáng)勢(shì)必對(duì)其在體實(shí)用性產(chǎn)生巨大的影響?，F(xiàn)有的去細(xì)胞方法以及去細(xì)胞試劑盒僅應(yīng)用于一種器官或組織，面向市場(chǎng)的范圍很狹小，商業(yè)價(jià)值較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本專利技術(shù)提出了一種用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒及其使用方法。用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒，包括非離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅱ、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑。所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1％～10％；所述的離子去垢劑Ⅰ采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1％～10％；所述的離子去垢劑Ⅱ采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1％～10％；所述的等滲溶液的濃度為0.01M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液；所述的組織疏松劑為由EDTA(乙二胺乙二酸)和胰酶溶于無(wú)菌等滲PBS配制，其中EDTA濃度為3.2％，胰酶濃度為4％；用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒的使用方法，目標(biāo)對(duì)象為神經(jīng)組織，置于-80℃～-20℃的低溫冰箱1～2h，1～2h后在25℃～45℃的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑中I振蕩處理4～8h，然后置于高滲溶液中震蕩4～8h，核酸酶去除劑處理30min～60min，等滲溶液沖洗2～24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架。試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100～300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，振蕩速度的選擇與不同物種來(lái)源的組織有關(guān)，以振蕩速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷組織完整性為宜，例如人的脊髓去細(xì)胞振蕩速度為100rpm/min，振蕩時(shí)可以采取相似的速度。目標(biāo)對(duì)象功能型復(fù)雜的全器官去細(xì)胞的流程，置于-80℃～-20℃的低溫冰箱12～48h，12～48h后在25-45℃的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，在低滲溶液中灌注組織疏松劑15min～60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6～24h，然后用PBS粉末配制的低滲溶液中灌注組織疏松劑15min～60min，核酸酶去除劑處理30min～60min，等滲溶液沖洗2～24h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架，上述有脈管系統(tǒng)的器官均灌注去細(xì)胞，肝臟以門靜脈灌注，腎臟以腎動(dòng)脈灌注，優(yōu)選的灌注速度為1～500ml/min,所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，灌注速度的選擇與不同物種來(lái)源的器官有關(guān)，以灌注速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷支架為宜，例如人腎臟的去細(xì)胞灌流速度為15ml/min，灌注時(shí)可以采用相似的速度。上述去垢劑第一次灌注時(shí)，會(huì)使器官?gòu)耐咙S色變成乳白色，去垢劑第二次灌注時(shí)，逐漸會(huì)使器官變成透明。目標(biāo)對(duì)象為功能單一的全器官的去細(xì)胞的流程，置于-80℃～-20℃的低溫冰箱12～48h，12～48h后在25℃～45℃的等滲無(wú)菌PBS緩沖溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，用低滲溶液中灌注組織疏松劑15min～60min，非離子去垢劑中灌注組織疏松劑處理6～24h，核酸酶去除劑處理30min～60min，等滲溶液沖洗2～24h，即可制備得到上述器官的去細(xì)胞支架上述有脈管系統(tǒng)的器官均灌注去細(xì)胞，心臟以冠狀動(dòng)脈灌注，胰腺以膽管灌注，肺臟以肺動(dòng)脈灌注。優(yōu)選的灌注速度為1～500ml/min,所有步驟均連續(xù)進(jìn)行，灌注速度的選擇與具體的動(dòng)物器官以及種類有關(guān)，以灌注速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷支架為宜，例如豬胰腺的去細(xì)胞灌流速度為6ml/min。經(jīng)去垢劑灌注后，器官會(huì)變透明。目標(biāo)對(duì)象為結(jié)締組織，由于自身結(jié)構(gòu)致密的特點(diǎn)，處理時(shí)間、去垢劑濃度較上述其他組織有所增加,具體步驟如下：置于-80℃～-20℃的低溫冰箱1～2h，1～2h后在25℃～45℃的等滲溶液中解凍，該過(guò)程可以根據(jù)組織的致密程度適當(dāng)重復(fù)，沖洗完全后在離子去垢劑中振蕩處理4～48h，然后置于低滲溶液中震蕩4～48h，在離子去垢劑II中再振蕩處理4～48h，然后放入低滲溶液中震蕩4～48h，核酸酶去除劑處理60min～120min，無(wú)菌等滲PBS沖洗6～24h，即可制備得到上述組織去細(xì)胞支架。在無(wú)菌條件下取出目標(biāo)組織后，試劑處理的優(yōu)選振蕩速度為100～300rpm/min，試劑處理均連續(xù)進(jìn)行，振蕩速度的選擇與具體的動(dòng)物有關(guān)，以振蕩速度不實(shí)質(zhì)性地?fù)p傷組織完整性為宜。例如兔的軟骨制備的振蕩速度為150rpm/min,振蕩時(shí)可以采取相似的速度。對(duì)于需要灌注法去細(xì)胞器官，離體前對(duì)器官灌注疏栓液；本專利技術(shù)提供的試劑盒及使用該試劑盒的方法能夠在短時(shí)間內(nèi)能夠獲取多器官和組織的去細(xì)胞支架，同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大部分結(jié)構(gòu)，從而再生醫(yī)學(xué)和組織工程的研究和運(yùn)用提供產(chǎn)品材料。更為重要的是本專利技術(shù)可有效便捷的獲取各個(gè)靶向器官和組織細(xì)胞外優(yōu)質(zhì)基質(zhì)蛋白和各類細(xì)胞因子，為相關(guān)疾病治療、美容整形以及健康保健方面等提供原料獲取方法。其中的非離子去垢劑(TritonX-100)能夠破壞脂質(zhì)與脂質(zhì)及脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用，有效地破壞細(xì)胞膜；離子去垢劑(SDS，DOC)能夠有效地破壞蛋白與蛋白之間的相互作用。凍融過(guò)程可以通過(guò)形成細(xì)胞內(nèi)冰晶破壞細(xì)胞膜從而有效地使細(xì)胞溶解，而低滲(高滲)溶液可以使細(xì)胞皺縮破壞細(xì)胞膜進(jìn)而溶解細(xì)胞，再結(jié)合能夠?qū)Ｒ恍缘厮庥锌乖缘暮怂岬暮怂崦?，最終可以獲得良好的去細(xì)胞支架。(上面有提到的幾類去細(xì)胞試劑都要講)具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)描述，但本專利技術(shù)的實(shí)施不僅限于此，本專利技術(shù)可運(yùn)用任何不同物種來(lái)源的具有細(xì)胞成分的組織和器官結(jié)構(gòu)。豬心臟去細(xì)胞實(shí)施例1.取用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒中溶質(zhì)與溶劑體積比為0.1本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒；其特征在于：包括非離子去垢劑、離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅱ、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑；所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX?100，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%～10%；所述的離子去垢劑Ⅰ采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%～10%；所述的離子去垢劑Ⅱ采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1%～10%；所述的等滲溶液的濃度為0.01M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液；所述的組織疏松劑為由EDTA和胰酶溶于無(wú)菌等滲PBS配制，以下為濃度為體積比，其中EDTA濃度為3.2%，胰酶濃度為4%。

【技術(shù)特征摘要】
1.用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒；其特征在于：包括非離子去垢劑、離子去垢劑Ⅰ、離子去垢劑Ⅱ、高滲溶液、低滲溶液、等滲溶液、核酸去除劑和組織疏松劑；所述的非離子去垢劑采用的溶質(zhì)為TritonX-100，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1％～10％；所述的離子去垢劑Ⅰ采用的溶質(zhì)為十二烷基硫酸鈉SDS，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1％～10％；所述的離子去垢劑Ⅱ采用的溶質(zhì)為脫氧膽酸鈉，溶劑為等滲無(wú)菌的PBS緩沖溶液，其體積比為0.1％～10％；所述的等滲溶液的濃度為0.01M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的高滲溶液濃度為0.2M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的低滲溶液濃度為0.005M的PBS緩沖溶液，并經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌；所述的核酸去除劑采用的是DNA酶，RNA酶的1:50的混合溶液；所述的組織疏松劑為由EDTA和胰酶溶于無(wú)菌等滲PBS配制，以下為濃度為體積比，其中EDTA濃度為3.2％，胰酶濃度為4％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于獲取多器官和組織細(xì)胞外基質(zhì)的試劑盒的使用方法，其特征在于：目標(biāo)對(duì)象為神經(jīng)組織，置于-80℃～-20℃的低溫冰箱1～2h，1～2h后在25℃～45℃的等滲溶液中解凍，用等滲溶液或生理鹽水沖洗3次，每次持續(xù)20分鐘，離子去垢劑I中振蕩處理4～8h，然后置于高滲溶液中震蕩4～8h，核酸酶去除劑處理30min～60min，等滲溶液沖洗2～24h，即可制備得到神經(jīng)組織類去細(xì)胞支架；所述振蕩速度為100～300rpm，各步驟均連續(xù)進(jìn)行；目標(biāo)對(duì)象功...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：倪金虎，林賢豐，張琪，何佳怡，陳蘊(yùn)繽，陳家鑫，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：林賢豐，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江;33