一種穩定性高的人源抗VEGF抗體及其應用制造技術

本發明專利技術提供了一種穩定性高的人源抗VEGF抗體及其應用。通過計算機輔助分子設計結合實驗驗證，對一株抗VEGF功能抗體的輕重鏈可變區進行熱穩定性改造，在不降低抗體親和力的前提下，獲得了熱穩定性更好的突變體抗體，將各突變位點進行疊加突變，獲得的突變體抗體熱穩定性較親本抗體最高提高7℃以上。本發明專利技術獲得的穩定性高的突變體抗體分子，有利于該抗體成藥后的儲存，同時為其他抗體的穩定性改造提供可供借鑒的經驗。

【技術實現步驟摘要】
一種穩定性高的人源抗VEGF抗體及其應用本申請是申請日為2013年3月8日、申請號為201310075262.X的專利技術名稱為“一種穩定性高的人源抗VEGF抗體及其應用”的專利技術專利申請的分案申請。
本專利技術涉及蛋白質工程領域，尤其是涉及治療用人源抗血管內皮細胞生長因子(VEGF)抗體的體外熱穩定性改造，具體地，涉及針對一株抗VEGF人源抗體，通過計算機分子模擬技術對抗體進行結構模建，并對影響抗體結構穩定性的氨基酸進行定點突變，通過實驗對突變體進行親和力和熱穩定性的評價，篩選獲得了熱穩定性明顯提高的突變體抗體。
技術介紹
與其他蛋白藥物相比，抗體藥物具有結構穩定、易于表達純化、易于儲存及體內半衰期長等特點，這也是其成為生物制藥領域領軍力量的重要原因之一。抗體的結構穩定性是影響其能否成為一個好的臨床藥物分子的重要因素之一，良好的結構穩定性是維持抗體與抗原特異性結合能力的基礎。抗體結構穩定性研究不僅是生物物理學中蛋白質折疊理論的重要組成部分，也是治療性抗體開發過程中必須面對的問題。結構穩定性不僅影響抗體的表達、純化和儲存，也影響其在體內與靶標抗原結合的親和力和特異性，從而導致其體內生物學活性的丟失或毒副作用的增加。人們對抗體穩定性的關注伴隨著治療性抗體產業的整個發展過程。對影響抗體結構穩定性的因素以及引發其結構不穩定的機制也進行了較深入的研究。熱失活是抗體結構的不穩定最常見的形式，評價抗體抗熱失活能力是評價其結構穩定性的重要指標。抗體的熱穩定性從本質上是指，抗體的天然態(Nativestate)與其去折疊態(Unfoldedstate)之間的自由能之差，即折疊自由能。理論上，抗體熱穩定性越高，其抗熱失活能力越強，這對抗體的開發具體重要的意義。首先，抗體的熱穩性越高，則其新生肽鏈在細胞內裝配時產生錯折疊(mis-folding)的概率越低，從而可溶性表達量也越高。因此，提高抗體的穩定性，可以大幅降低生產成本，從而使得藥物便于普及。其次，近十年的研究還表明，抗體的熱穩定性與其在體內對各種蛋白酶的耐受性是相關的。抗體熱穩定性越高，則其結構折疊的越緊湊，進而其內部的蛋白酶切位點越不容易暴露在外，因此在體內越不容易被蛋白酶降解，從而使得其在相同體內清除速度下在體內的剩下有效成分越多，而這在客觀上使得在給藥劑量相同的情況下其血藥濃度越高。更重要的是，抗體的穩定性是其行使正確生物學功能的保障，抗體穩定性越高，其在體內保持生物活性的時間也越長。由此可見，較高的熱穩定性，是一株治療性抗體能否最終走上臨床并投放市場的關鍵因素之一。除此以外，抗體的熱穩定性對于其保質期及存放條件等性質也是至關重要的。熱穩定越高，則在相同條件下的保存時間也就越長，而且對保存環境的要求也相對較低——而這在一定程度上也降低了抗體的儲存和物流成本。因此，在保證抗體親和力、特異性及表達量等性質不受太大影響的情況下，最大程度上提高其熱穩定性，對于抗體藥物研發具有重要的現實意義與應用價值。目前，針對抗體穩定性改造的比較經典的幾種方法包括：CDR移植的方法，基于晶體結構的計算機輔助分子設計、基于抗體同源模建的計算機輔助分子設計、基于蛋白質折疊理論指導下的分子改造策略以及基于已有結構知識的分子改造策略等。在以往的研究中，針對抗體穩定性改造成功的報道很多，其所采用的方法也不盡相同。通過上述的一種或幾種方法的應用，均有成功案例的報道。盡管這些技術方法還未形成成熟的技術體系，但這些研究卻為更深入的了解抗體結構穩定性提供了大量的素材。由于抗體包括輕、重鏈兩條鏈，因此其結構比較復雜，其整體結構的穩定性取決于：輕鏈和重鏈各自的穩定性、輕重鏈之間的界面穩定性及鉸鏈區穩定性等幾個方面，而輕重鏈的穩定性又細分為局部穩定性和整體穩定性。從影響蛋白結構穩定性的影響因素分析，影響局部穩定性因素包括局部結構熵、折疊和去折疊自由能、β轉角位置及類型、特殊氨基酸如Pro和Gly所處位置是否合理、內部和表面氨基酸與其所處環境十分和諧及增加關鍵部位的氫鍵和其他有利于結構穩定的作用力等，而分子的整體穩定性除了取決于局部穩定性之外，還應考慮分子整體的去折疊次序和去折疊能量勢壘等分子的熱動力學特征。這些都是指導抗體穩定性改造的重要思路和技術方法。抗體分子是一類較特殊的蛋白分子，其結構除重鏈CDR3變化巨大外，其他5個CDR區及框架區的結構變化較小，大部分抗體在除HCDR3以外的部分具有較相似的標準化結構特征。抗體的這種結構特征，為將計算機輔助藥物設計(ComputerAidedDrugDesign，CADD)用于抗體的分子改造提供了可能。目前，通過計算機輔助分子設計的方法提高抗體結構穩定性的成功案例很多。從本質上來講，CADD是分子模擬(molecularmodeling)方法在制藥領域的綜合應用。隨著分子模擬理論的完善及技術的進步，分子模擬方法正越來越多地被用于蛋白質結構-功能關系、蛋白質與配體的相互識別以及藥物設計的研究工作當中。現在，分子模擬方法在某些方面已經成為實驗研究難以替代的手段。按照分子模擬方法的理論基礎，可將其大致分為三類，即基于牛頓力學，基于量子力學和基于知識的分子模擬方法。其中基于牛頓力學的分子模擬方法包括分子動力學模擬(moleculardynamicssimulation)、分子對接(moleculardocking)和同源模建(homologymodeling)等各種經典方法。其優點是理論基礎扎實，計算速度較快，且在絕大多數情況下計算結果可靠，因此成為了當今分子模擬領域的主流方法。計算機輔助分子模擬為了解抗體及復合物的結構提供了良好的平臺支持，近年來，通過計算機輔助分子模擬對抗體分子進行設計或改造，尤其是對抗體進行體外親和力成熟的成功報道越來越多，證明該技術在抗體研制領域具有重要的作用，國際上甚至開始嘗試通過計算機模擬篩選的方法獲得所需要的目標抗體。然而，由于我國的抗體藥物開發起步較晚，相關的技術方法體系還處于建立初期，少有利用計算機分子分子設計進行抗體分子優化的報道，尤其尚未發現將其用于抗體穩定性改造的報道。申請人一直從事原創性治療性抗體的研發工作，通過自構建的大容量人抗體資源庫技術獲得了一些原創性候選抗體品種。在VEGF靶標抗原治療性抗體的研究中，申請人獲得了一株在體外具有和貝伐單抗中和活性相當的抗體分子，有望成為全新的抗VEGF候選藥物。但其結構穩定性較差。因此需要獲得穩定性明顯改善的突變體抗體分子，為其進一步開發抗VEGF藥物奠定基礎，同時也希望完善對抗體分子物理結構穩定性的理論認識以及計算機輔助藥物分子設計在該領域的不足和缺陷，為其他抗體藥物的改造提供技術和理論支持。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供熱穩定性明顯提高的抗VEGF抗體及其活性片段。本專利技術的第二個目的在于提供抗VEGF抗體的應用。本專利技術運用計算機分子模擬技術對一株熱穩定性和體外放置穩定性很差的抗VEGF功能抗體的可變區進行了全方面穩定性改造，通過親和力和穩定性篩選，最終獲得了多個親和力基本不變，但對該抗體穩定性具有正向作用的輕、重鏈突變位點，并進一步證實這些突變位點可以進一步通過疊加突變，使抗體熱穩定性進一步提高。最終其熱穩定性較親本抗體提高7℃以上。本專利技術提供的抗體，各種抗體形式均包含在內。如，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人源抗VEGF抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示，其重鏈可變區的氨基酸如SEQ?ID?No.6所示。

【技術特征摘要】
1.一種人源抗VEGF抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如S...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王雙，孫志偉，曾大地，常紅艷，仇瑋祎，孫九如，范志和，楊濤，范鐵炯，
申請(專利權)人：上海賽倫生物技術有限公司，中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所，上海賽倫生物技術大豐有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31