一種殺蟲蛋白及其編碼基因與應用制造技術

本發明專利技術涉及一種殺蟲蛋白Cry1m7，所述殺蟲蛋白為1)由SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或2)在SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列中經取代、缺失或插入一個或幾個氨基酸序列所獲得的具有同等活性的蛋白質。本發明專利技術還提供了所述殺蟲蛋白的編碼基因、表達載體、工程菌、所述蛋白在殺蟲藥劑中的應用以及所述蛋白的編碼基因在轉化植物中的應用。本發明專利技術提供了一種高毒力的殺蟲蛋白Cry1m7及其編碼基因；本發明專利技術所提供的殺蟲蛋白可以用于殺死亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲，提高轉基因作物的殺蟲能力。

【技術實現步驟摘要】
一種殺蟲蛋白及其編碼基因與應用
本專利技術涉及基因工程領域，特別涉及一種殺蟲蛋及其編碼基因與應用。
技術介紹
蟲害是造成農作物嚴重減產的一個主要因素，防治農業害蟲最常見的手段就是使用廣譜化學殺蟲劑和一些生物殺蟲劑。化學殺蟲劑多具有廣譜、高毒的特點，在殺死目標害蟲的同時往往將很多益蟲一起殺死，嚴重破壞生態平衡，并對環境造成嚴重污染；另一方面，農藥殘留對人類、牲畜的健康也造成嚴重威脅。生物殺蟲劑具有易降解、與環境高度相容的特點，但在生產上需要重復施用，大大增加生產成本。為了彌補化學殺蟲劑和生物殺蟲劑在農業生產應用中的弊端，科學家們將能編碼殺蟲蛋白的基因導入到植物體內，培育出多種轉基因植物。自1996年至今，已經有多種轉Bt基因殺蟲作物獲得批準進行商業化生產，但這些抗蟲轉基因作物多使用Cry1A類殺蟲蛋白基因，殺蟲蛋白基因的單一化、大面積使用加速害蟲抗性的產生，制約了轉Cry1A類抗蟲轉基因作物的應用年限。因此，需要不斷尋找高毒力、且與已經使用的殺蟲蛋白基因無交互抗性的新的基因以延緩害蟲抗性的產生。目前，人們已經克隆了數百種Bt殺蟲蛋白基因，但這些殺蟲蛋白基因真正能應用于生產的卻屈指可數，其原因主要是毒力較低，容易使害蟲產生抗性；其次，多數基因存在不同程度的交互抗性。賀明霞等的研究結果表明Cry1Ie與Cry1Ab、Cry1Ac及Cry1Fa三種毒素不存在交互抗性，但Cry1Ab和Cry1Ac的交互抗性較高，Cry1Fa與Cry1Ab和Cry1Ac也存在一定程度的交互抗性(He，2013)。Gassmann等的研究結果表明孟山都公司培育的殺蟲玉米轉化事件MON88017中所使用的殺蟲蛋白基因Cry3Bb1與先正達公司培育的殺蟲玉米轉化事件MIR604中所使用的殺蟲蛋白基因mCry3A存在交互抗性，這使西方玉米根蟲在兩種玉米商業化使用三年內就對兩種殺蟲蛋白基因產生了嚴重的抗性，對玉米生產造成嚴重損失(Gassmann,2014)。除此之外，殺蟲蛋白基因克隆資源的日漸匱乏也給基因克隆造成很大難度。以上因素都增加了具有應用潛力殺蟲蛋白基因克隆的難度。Cry1I類Bt蛋白對害蟲有很好的殺蟲活性。Cry1Ia1基因編碼的殺蟲晶體蛋白對鱗翅目和鞘翅目昆蟲具有毒害作用，已用于培育抗馬鈴薯塊莖蛾的轉基因馬鈴薯如SpuntaG2及抗大豆食心蟲的轉基因大豆。Cry1Ie基因編碼的殺蟲晶體蛋白對鱗翅目害蟲如小菜蛾、玉米螟有很高的抗性，且與商業化應用的一些抗蟲基因不存在交互抗性。轉Cry1Ie基因抗蟲玉米高抗亞洲玉米螟，而且可以有效殺死對Cry1Ac蛋白產生抗性的棉鈴蟲，具有重大應用價值(Zhang，2013)。但Cry1Ie蛋白的毒力比殺蟲蛋白Cry1Ac低，在某種程度上限制了其應用。因此，有必要對其進行改造，進一步提高Cry1Ie殺蟲蛋白的毒力。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有研究中存在的上述缺陷，提供一種毒力顯著高于Cry1Ie、Cry1Ia的一種新型殺蟲蛋白基因及其編碼蛋白。為了實現本專利技術的目的，本專利技術首先提供一種殺蟲蛋白Cry1m7，所述殺蟲蛋白由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列組成。應當理解的是，本領域技術人員可以根據SEQIDNO:1所示的氨基酸序列在不影響其活性的條件下，對該序列進行取代、缺失或插入一個或幾個氨基酸序列以獲得具有同等活性的蛋白質。本專利技術的專利技術人以Cry1Ie(GenBank：AF211190.1)和Cry1Ia1(GenBank：X62821.1)為參考序列，進行結構域改造，得到重組殺蟲蛋白Cry1m7。本專利技術還提供了編碼所述蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本專利技術所提供的基因包括所述蛋白相應的編碼核酸序列。應當理解的是，由于密碼子具有簡并性以及不同物種密碼子所具有的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。在本專利技術中，所述核苷酸序列采用了玉米偏愛性密碼子。本專利技術還提供了所述基因的表達載體，其中，所述表達載體包括誘導表達載體和植物表達載體。本專利技術還提供了含有所述基因的工程菌。本專利技術還提供了基因Cry1m7在轉化植物中的應用。進一步地，所述應用是在植物體內表達所述殺蟲蛋白的編碼基因，提高植物的抗害蟲能力。進一步地，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱。進一步地，所述害蟲為鱗翅目害蟲，包括但不限于亞洲玉米螟、棉鈴蟲和粘蟲。本專利技術還提供了殺蟲蛋白Cry1m7在殺蟲藥劑中的應用。本專利技術所獲得的有益效果在于：提供了一種高毒力的殺蟲蛋白Cry1m7及其編碼基因；本專利技術所提供的殺蟲蛋白可以用于殺死亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲，提高轉基因作物的殺蟲能力。附圖說明圖1為pET30a酶切載體與基因Cry1m7連接產物轉大腸桿菌不同菌斑的PCR產物；M：DL2000plusDNAmarker；1-6：pET30a酶切載體與基因Cry1m7連接產物轉大腸桿菌不同菌斑的PCR產物；圖中箭頭所指的位置為2525bp。圖2為質粒pET30a-Cry1m7經BamHI和SacI雙酶切產物的瓊脂糖電泳圖；M：DL2000plusDNAmarker；1：質粒pET30a-Cry1m7雙酶切產物。圖3為含有Cry1m7或Cry1Ie抗蟲基因的pET30a載體圖；其中pET30a-Bt中Bt示意殺蟲基因名字Cry1m7或Cry1Ie。圖4為Cry1m7殺蟲蛋白基因蛋白誘導純化后SDS-PAGE電泳檢測；M：PageRulerPrestainedProteinLadder；1：Cry1Ie；2：Cry1m7。圖5為植物表達載體p3301Ubi-Cry1m7構建時Cry1m7基因PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖；M：DL2000plusDNAmarker；1：Cry1m7。圖6為含有Cry1m7殺蟲蛋白基因的p3301Ubi-Cry1m7植物表達載體圖。具體實施方式下面將通過具體實施方式對本專利技術進行詳細說明。實施例1Cry1m7誘導表達載體的構建。Cry1m7的基因序列委托上海生工合成并構建到pUC57載體上，構成具有氨芐青霉素抗性的質粒pUC57-Cry1m7。將質粒pUC57-Cry1m7及質粒pET30a(購自美國Novagen公司)各取20ng加入到50μL大腸桿菌感受態細胞Trans5α中，冰浴30min；42℃熱激90sec，冰浴2min；加入300μLLB液體培養基，37℃低速振蕩恢復培養1hr后，將菌液涂于含相應抗生素的平板上，晾干；37℃培養箱倒置培養15hr。挑取單克隆菌斑于10ml含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃搖床震蕩過夜培養，次日，依照天根質粒小提中量提取試劑盒操作步驟提取質粒，并用NanoDrop2000C微量紫外分光光度計對提的質粒定量。選擇在質粒上有單一酶切位點且恰位于基因兩端的限制性內切酶BamHI和SacI雙酶切質粒pUC57-Cry1m7及pET30a，使基因與載體的兩端具有相同的粘性末端。pUC57-Cry1m7酶切后，經瓊脂糖膠電泳，對照Marker分別切取約2.1kb大小左右的片段，用天根膠回收試劑盒對核酸片段進行回收；質粒pET30a經雙酶切后用天根純化試劑盒進行純化回收。然后，按照T4連接酶的使用說明將切膠回收的核酸片段與純化回收的載本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種殺蟲蛋白Cry1m7，其特征在于：1)由SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或2)在SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列中經取代、缺失或插入一個或幾個氨基酸序列所獲得的具有同等活性的蛋白質。

【技術特征摘要】
1.一種殺蟲蛋白Cry1m7，其特征在于：其為由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質。2.權利要求1所述的殺蟲蛋白的編碼基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.含有權利要求2所述基因的表達載體。4.含有權利要求2所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉允軍，張煜文，王國英，何康來，
申請(專利權)人：中國農業科學院作物科學研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11