一種棕櫚疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種棕櫚疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。該LAMP檢測引物組合物由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物LF和反向環(huán)引物LB組成；各引物序列具體如下：FIP：5′-CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3′；BIP：5′-TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3′；F3：5′-GCGGAAGGGACTACACCT-3′；B3：5′-AACAACAACACCGAGGCC-3′；LF：5′-ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3′；LB：5′-GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3′。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種棕櫚疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法
本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種棕櫚疫霉菌的LAMP檢測引物組合物及其LAMP檢測試劑盒和LAMP檢測方法。
技術(shù)介紹
棕櫚疫霉菌(Phytophthorapalmivora)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一種危害極為嚴重的病原菌，能夠侵染根、莖、葉、花以及果實等各個部位，在氣候潮濕的條件下發(fā)病更為嚴重。。棕櫚疫霉菌屬于卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)。棕櫚疫霉引起的植物病害分布廣泛，所以建立棕櫚疫霉的快速分子檢測技術(shù)對于其引起疫病的早期控制具有重要意義。目前對該病害還沒有快速有效的防治措施，控制該病的最有效途徑就是加強檢疫，防止病原菌的傳播和阻礙其擴散方式。傳統(tǒng)的棕櫚疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態(tài)學特征、致病性測定、生理生化特征等。傳統(tǒng)方法在棕櫚疫霉菌檢測中發(fā)揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業(yè)的疫霉分離、形態(tài)學鑒定知識和豐富的經(jīng)驗。隨著核酸相關(guān)的鑒定方法的發(fā)展，PCR技術(shù)為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優(yōu)勢，雖然PCR法在特異性和敏感性上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4～5h，同時PCR方法依賴精密的溫度循環(huán)裝置。其檢測靈敏度比較高，但是檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本的榮研株式會專利技術(shù)的一種新的核酸擴增技術(shù)，因為其操作簡單、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點，成為可以替代PCR的新的核酸擴增技術(shù)。它是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60～65℃范圍80min內(nèi)，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強，并且核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，普通水浴鍋或者有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能滿足反應(yīng)要求，檢測成本大大降低。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟等特征，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。自LAMP檢測技術(shù)建立14年以來，該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于對病毒、細菌、寄生蟲、真菌等病原菌的檢測研究，但在植物病原卵菌的檢測報道很少，棕櫚疫霉菌的檢測國內(nèi)外均未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
專利技術(shù)目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中棕櫚疫霉菌生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差、靈敏度低的問題，本專利技術(shù)的目的是提供一種棕櫚疫霉菌的LAMP檢測引物組合物。本專利技術(shù)的另一目的是提供上述棕櫚疫霉菌的LAMP檢測試劑盒。本專利技術(shù)還有一目的是提供上述棕櫚疫霉菌的LAMP檢測方法。技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測棕櫚疫霉菌的LAMP檢測引物組合物：由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物LF和反向環(huán)引物LB組成；各引物序列具體如下：FIP：5′-CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3′；BIP：5′-TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3′；F3：5′-GCGGAAGGGACTACACCT-3′；B3：5′-AACAACAACACCGAGGCC-3′；LF：5′-ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3′；LB：5′-GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3′所述的LAMP檢測引物組合物在檢測棕櫚疫霉菌的中的應(yīng)用。一種檢測棕櫚疫霉菌的LAMP檢測試劑盒：包含1mL檢測溶液，所述的檢測溶液包括：32mM正向內(nèi)引物FIP、32mM反向內(nèi)引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM環(huán)引物LF、8mM環(huán)引物LB、50mMdNTPs、0.8MTris-HC、0.4mMKCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mMMgSO4、4％TritonX-100、BstDNApolymerase320單位，200mM羥基萘酚藍；其中，各引物序列具體如下：FIP：5′-CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3′；BIP：5′-TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3′；F3：5′-GCGGAAGGGACTACACCT-3′；B3：5′-AACAACAACACCGAGGCC-3′；LF：5′-ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3′；LB：5′-GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3′。所述的檢測棕櫚疫霉菌的LAMP試劑盒在檢測棕櫚疫霉菌的中的應(yīng)用。一種檢測棕櫚疫霉菌的LAMP檢測方法：包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行LAMP；擴增產(chǎn)物觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化，天藍色表示檢測為陽性，存在棕櫚疫霉菌；紫色表示檢測結(jié)果為陰性，不存在棕櫚疫霉菌。所述的檢測棕櫚疫霉菌的LAMP檢測方法：提取待檢微生物的DNA，取1μLDNA溶液，加入23μLLAMP試劑盒中的檢測溶液和1μL滅菌去離子水進行LAMP，LAMP反應(yīng)程序為：60℃～65℃，50～70min。本專利技術(shù)的檢測棕櫚疫霉菌的方法，包括提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用所述的LAMP引物組合物進行LAMP；羥基萘酚藍(hydroxylnaphtholblue，HNB)屬于金屬離子指示劑的一種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監(jiān)測LAMP反應(yīng)體系中Mg2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加入到反應(yīng)液中，反應(yīng)體系呈紫色，反應(yīng)過程中Mg2+與LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物P2O74-結(jié)合產(chǎn)生大量沉淀，溶液中Mg2+濃度降低，pH發(fā)生變化，從而使HNB的顏色由紫色變?yōu)樘焖{色。因此，反應(yīng)結(jié)束后通過反應(yīng)體系的顏色變化，來判斷棕櫚疫霉菌的有無：天藍色表示檢測為陽性，存在棕櫚疫霉菌；紫色表示檢測結(jié)果為陰性，不存在棕櫚疫霉菌。本專利技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)之一是棕櫚疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證棕櫚疫霉菌的特異性引物序列，本專利技術(shù)以6株棕櫚疫霉菌菌株和13種其它卵菌以及19種病原真菌為供試材料(表1)，采用CTAB法提取發(fā)病組織中棕櫚疫霉菌的DNA。具體方法如下：取少量菌絲粉，加900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，漩渦混勻，于55℃水浴1h，中間每10min上下顛倒幾次。12000rpm離心10min，取上清液加等體積酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，顛倒混勻，12000rpm離心10min；將上清液轉(zhuǎn)移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，12000rpm離心5min。上清轉(zhuǎn)移至新管中，加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm離心10min，傾去上清，沉淀用70％乙醇洗滌兩次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種用于檢測棕櫚疫霉菌的LAMP引物組合物，其特征在于：由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物LF和反向環(huán)引物LB組成；各引物序列具體如下：FIP：5′?CTCACTTCAACAGCCCCGCC?GAAGTGTGCTGCGTCGTG?3′；BIP：5′?TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA?CAACCTGCAACCACCGAA?3′；F3：5′?GCGGAAGGGACTACACCT?3′；B3：5′?AACAACAACACCGAGGCC?3′；LF：5′??ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG?3′；LB：5′?GCTGCGAGTGGTTTGTGACT?3′。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測棕櫚疫霉菌的LAMP引物組合物，其特征在于：由正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物LF和反向環(huán)引物LB組成；各引物序列具體如下：FIP：5′-CTCACTTCAACAGCCCCGCC-GAAGTGTGCTGCGTCGTG-3′；BIP：5′-TCGGCTAAAGTGACGGCTTTGA-CAACCTGCAACCACCGAA-3′；F3：5′-GCGGAAGGGACTACACCT-3′；B3：5′-AACAACAACACCGAGGCC-3′；LF：5′-ACAGAGCAAGAAGCGAATTAGAG-3′；LB：5′-GCTGCGAGTGGTTTGTGACT-3′。2.權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測棕櫚疫霉菌中的應(yīng)用。3.一種檢測棕櫚疫霉菌的LAMP試劑盒，其特征在于：包含1mL檢測溶液，所述的檢測溶液包括：32mM正向內(nèi)引物FIP、32mM反向內(nèi)引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM環(huán)引物LF、8mM環(huán)引物LB、50mMdNTPs、0.8MTris-HCl、0.4mMKCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mMMgSO4、4％TritonX-100、BstDNApolymerase3...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴婷婷，吳小芹，康振燁，
申請(專利權(quán))人：南京林業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32