本發明專利技術提供了對高通量樣本逐個細胞分析和關聯表型和基因型信息的方法和裝置。分離細胞，并逐個分析了其表型信息和基因型信息，然后將所述表型信息和基因型信息相關聯。在微流通道網絡內在連續流動樣品上或在預裝進納孔陣列芯片的樣品上使用對樣品群的表型-基因型信息進行相關性分析的方法。進行表型-基因型分析及其相關性分析的方法可規模化的用于從數百個細胞到數千個細胞到數萬個和數十萬個細胞的樣品量。
【技術實現步驟摘要】
關聯的多參數單細胞測定及殘余生物材料回收的方法和裝置本申請是申請號200880107316.3，申請日為2008年8月8日的同名申請的分案申請。
本專利技術涉及對將基因組材料進行分選、收集而獲得的高通量樣品中的蛋白和核酸逐個細胞進行自動的、關聯的定量測定的方法和裝置。相關申請本國際申請要求2007年8月9日提交的名稱為“關聯的多參數單細胞測定及殘余生物材料回收的方法”的臨時申請No.60/954,946的權利，將所述臨時申請通過引用整體并入本文。
技術介紹
熒光激活細胞分選(FACS)在研究和臨床應用中廣泛使用。所述儀器具有非常快速地進行多參數分析和分選的能力，但其通常需要大樣品量和進行操作和維護的訓練有素的操作員，且難以消毒。FACS儀器可分析少至10000個和多達幾千萬個細胞。而在分選應用中，進行分選的能力降低，因為樣品大小小于100,000個細胞。在所有情況下，所述細胞必須事先標記。大多數情況下，使用綴合了熒光分子(如異硫氰酸熒光素，又名FITC)的抗體標記抗原或相似的膜結合蛋白，但核染色劑、胞內染料或細胞指導的熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白，又名GFP)合成也可通過流式細胞術檢測。流式細胞術也適用于分子檢測。例如，可將具有多種顏色和/或強度的熒光珠用作固體支持物以用于蛋白或多肽分析物的抗體捕獲測定。同樣，可將核酸與珠和熒光標記雜交，以使用流式細胞術來進行快速讀取。在這兩種情況下，在使用流式細胞術測定前進行生物化學測定，并可將所述儀器作為珠快速讀取儀使用。在某些情況下，掃描式細胞術在讀取中同樣有效。FACS儀器支持至所述儀器支持的獨立熒光通道數的多個信息，但所述多個信息為單一類型(例如，僅表型)。實時聚合酶鏈反應(又名qPCR)是用于定量測定從目的細胞中提取的DNA和RNA的技術。使用相當于10,000～100,000個細胞的合并基因組量來進行大多數qPCR反應。研究人員對測定個細胞的遺傳內容越來越感興趣，但此努力被當前可用的高成本試劑和勞動密集性操作法所阻礙。因此，大多數單細胞PCR研究僅在少于100個上細胞進行。即使現有的機器人技術和用量為1～10μL/孔的1536微孔板仍比幾百孔的花費昂貴。當出現目的細胞占細胞數量的比例少于1％的罕見情況時需要將達50000個的細胞逐一進行檢查。沒有大量時間和金錢的花費，目前的技術無法達到這種通量水平。在信號轉導的研究和系統生物學的工作中，通常需要使差異信息相關聯。將細胞表面受體或報告子與胞內信號轉導鏈接的數據對這些活動越來越有價值。迄今為止，所述信息基于大量細胞相關聯。通常情況下，測定數千至數百萬計的細胞的表面蛋白或RNA表達，并將所述信息在統計學上相關聯。在測定過程中，樣品的任何異質性被平均。siRNA基因沉默之類的強大技術本身可將異質性導入樣品中，從而受到此信息平均的限制。許多研究者已得到了逐個細胞定量關聯基因型的蛋白(或其他的表型特征)和核酸的值。微流術(microfluidics)已被確定為一項能使儀器進行所述測定的技術，但還未產生作為例子的方法和儀器。微加工式細胞儀具有分析和分選少達1000個細胞的潛力，而在易于使用的封閉體系中隨之消耗的試劑更少。當用復制酶之類的高成本試劑工作時前者是重要的。而后者是重要的，因為與常規的FACS儀器不同，其不產生氣溶膠，減少污染分選細胞和與生物有害材料工作的風險。已描述了幾種微加工細胞分析儀和分選儀，但大多數為“概念證明”。通過對微加工式細胞儀、單細胞包裹技術和適當信號處理的這些元件進行結合，可生產出具有逐個細胞檢測蛋白表達和基因表達的相關性的儀器。
技術實現思路
如下所述，在微流網絡中這些元件組合實現相關測定。事先標記細胞，以進行表型測定。在一實施方式中，連續流動的微流網絡集成了所有功能。在微流網絡的第一部分中，測定細胞的表型標記產生的熒光信號。微流網絡的第二部分在微反應器中將細胞與適合基因表達測定的預定混合試劑進行獨立包裹。在微流網絡的下一部分中，用可包含在微反應器內容物中或從其中分離的參照信號來編碼包裹的細胞流。在微流網絡的第四部分中，裂解細胞，并用適宜技術(例如，實時聚合酶鏈反應(又名實時PCR)或qPCR)測定基因表達。然后在下一階段解碼微反應器流，且信號處理算法關聯表型和基因型測定值。作為最后一個可選步驟，可分選微反應器，以富集特定基因組。在相關實施方式中，首先包裹細胞，從而表型分型和編碼同時發生。隨后裂解細胞，然后同時進行基因表達測定和解碼。這減少微流網絡上的詢問點數。在第二實施方式中，組合微流網絡與微孔陣列，以分離個細胞，并關聯用戶預選的遺傳信息與表型群。在第一部分中，用微流網絡測定細胞的表型標記產生的熒光信號。在第二部分中，用多路徑切換網絡將細胞分選入個納流(nanofluidic)微孔。所述孔排列成各細胞位于唯一確定的坐標中，或所述孔可排列成將細胞分入2個以上的陣列中。在后一種情況下，用戶基于獲得的表型信息選擇一個以上的門來選擇細胞的所欲目的地。密封所述孔，以用適合基因表達測定的預定混合試劑獨立包裹所述細胞。裂解所述細胞，并用適宜技術通過讀取陣列來測定基因表達。可分析微孔中的反應信息，以檢測遺傳信號的統計學分布，且可將所述信息反過來與選定表型離散性關聯。作為最后的可選步驟，可收集個微孔內容物，用于進一步的基因分析。在第三實施方式中，使用利用納流(nanofluidic)微孔陣列的掃描式細胞術分離個細胞，并獲取關聯的表型和基因型信息。同樣，事先標記細胞，以進行表型測定。將所述細胞置于所述微孔中，并密封所述孔，以用適合基因表達測定的預定混合試劑獨立包裹所述細胞。對細胞的掃描式細胞術分析收集了指向所述孔坐標的表型信息，裂解所述細胞，然后用適宜技術通過讀取陣列來測定基因表達。級聯所述信號至單相關數據集。作為最后的可選步驟，可收集個微孔內容物，用于進一步的基因分析。在所有的實施方式中，可進行一個以上的表型測定。通常情況下，可同時檢測到至4個或5個獨立熒光信號。各反應中基因表達測定值可為一種基因的測定值或優選為兩種以上基因復合的測定值，以獲得關于選定基因表達水平的標準化的定量信息。附圖簡述圖1為示本專利技術的如何逐個獲得和關聯分析用表型(例如用熒光偶聯抗體標記的細胞表面蛋白)信息和基因型(例如單細胞、多重定量PCR)信息的概念圖。圖2為連續流形式的本專利技術元件的原理框圖。圖3為改良的連續流形式或掃描式細胞術形式的本專利技術元件的原理框圖。圖4為在圖2的連續流實施方式中使用的微流元件的示意圖。圖5為在圖2的連續流實施方式中如何通過周期事件或非周期事件的編碼和解碼來獲得表型和基因型測定關聯的例子的示意圖。圖6為用于進行表型和基因型關聯的、包含獨立式一次性盒和儀器的集成系統的實施方式的原理框圖。圖7示圖6所示與微流網絡一起使用的樣品裝載盒的實施方式。圖8示用于逐個細胞進行表型和基因型分析和關聯的樣品裝載器、微流裝載芯片和毛細管的實施方式。圖9A示與圖8所示的毛細管一起使用的熱控組件的實施方式。圖9B示在圖9A所示的熱控組件中的毛細管夾持器的實施方式。圖9C示在圖9A所示的熱控組件中的毛細管夾持器的另一實施方式。圖10示與圖7所示用于逐個細胞進行表型和基因型分析和關聯的樣品裝載器一起使用的微流芯片的實施方式。圖11示本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用于進行各細胞的分子分析的集成系統，其包括：樣品源，包含至少一個含有多個細胞的水溶液；試劑混合物，其支持核酸擴增和細胞的定量分析；陣列，其包含多個樣品室，每個樣品室包含含有細胞和試劑混合物的納米流體微孔，所述納米流體微孔的尺寸為基本上含有來自樣品源的1個單個細胞；所述納米流體微孔用來支持核酸擴增和細胞的定量分析，并設置成提供光學入口到樣品室的內容物；沉淀器，用于隨后沉淀來自在陣列的多個納米流體微孔樣品室中的所述樣品源的細胞；包裹介質，用于分離多個樣品室中的細胞和試劑混合物，所述的包裹介質通過進行疏水流體油封而使所述多個樣品室彼此分隔，同時允許物理入口進入到每個樣品室，并且發揮降低試劑混合物從樣品室的揮發的功能；至少一個光學檢測器，其可操作性地連接于該陣列，檢測器被設置成測定來自多個樣品室的信號并生成呈現該信號的輸出信息；熱模塊，其包含加熱元件和熱控制元件，其可操作地連接在該陣列上，該熱模塊被設置成進行以適合于在所述樣品室實現核酸擴增的溫度來進行陣列的熱循環；靶收集器裝置，其可操作地逐個提取來自所述多個樣品室擴增的核酸材料；和處理器，其配置成接收來自光學檢測器的輸出信息。
【技術特征摘要】
2007.08.09 US 60/954,9461.用于進行各細胞的分子分析的集成系統，其特征在于其包括：樣品源，包含至少一個含有多個細胞的水溶液；試劑混合物，其支持核酸擴增和細胞的定量分析；陣列，其包含多個納米流體微孔，所述納米流體微孔的尺寸為基本上含有來自樣品源的1個單個細胞和試劑的混合物；所述納米流體微孔用來支持核酸擴增和細胞的定量分析，并設置成提供光學入口到納米流體微孔的內容物；沉淀器，用于隨后沉淀來自在陣列的多個納米流體微孔中的所述樣品源的細胞；包裹介質，用于分離多個微孔中的細胞和試劑混合物，所述的包裹介質通過進行疏水流體油封而使所述多個微孔彼此分隔，同時允許物理入口進入到每個微孔，并且發揮降低試劑混合物從微孔的揮發的功能；至少一個光學檢測器，其可操作性地連接于該陣列，檢測器被設置成測定來自多個微孔的信號并生成呈現該信號的輸出信息；熱模塊，其包含加熱元件和熱控制元件，其可操作地連接在該陣列上，該熱模塊被設置成進行以適合于在所述微孔實現核酸擴增的溫度來進行陣列的熱循環；靶收集器裝置，其可操作地逐個提取來自所述多個微孔擴增的核酸材料...
【專利技術屬性】
技術研發人員：A·S·卡茲，H·張，K·安，Y·張，
申請(專利權)人：賽路拉公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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