一種高純度眼鏡蛇神經毒素的提取方法及含有該毒素的藥物組合物技術

本發明專利技術申請鑒于眼鏡蛇蛇毒成分的復雜性和科博肽為堿性多肽、分子量大約7000道爾頓左右、相對耐熱耐酸堿等理化性質，綜合考慮各種層析柱填料的分離機理、應用特點、長期使用的穩定性、成本的可控性以及提取目標的達成，提供一種高純度眼鏡蛇神經毒素的提取方法，該方法工藝穩定、層析填料易得、綜合成本低、操作條件適應性好、神經毒素的收率高。本發明專利技術申請進一步提供由上述方法制備得到的高純度科博肽，用它制成的注射用科博肽制劑中與治療作用無關的雜質少、治療作用起效快、療效穩定。本發明專利技術申請還提供幾種以高純度科博肽為有效成分，配方制成制劑所必要的制劑輔料的藥物組合物及不同的劑型，適合口服、口腔吸收、直腸給藥的科博肽制劑。

【技術實現步驟摘要】
一種高純度眼鏡蛇神經毒素的提取方法及含有該毒素的藥 物組合物
本專利技術申請涉及一種高純度眼鏡蛇毒神經毒素的提取方法及以該毒素為單一有 效成分的藥物組合物，所述藥物組合物適合口服、口腔吸收和直腸給藥，特別涉及一種以高 純度科博肽為主藥的口服、口腔吸收、直腸給藥的制劑，屬于生物和生化制藥領域。
技術介紹
神經毒素（neurotoxin，NT)是蛇毒中一類重要的活性組分，主要分布在眼鏡蛇科 和海蛇科及蝰科的響尾蛇蛇毒中。純化的微量眼鏡蛇毒神經毒素具有類似嗎啡的中樞鎮痛 作用，用于頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關節痛的鎮痛治療。NT的鎮痛作用有別于阿片類藥 物，表現為效價高、持續時間長、無耐受性和成癮性，是一種很有潛力的新型鎮痛藥。研究表 明，NT的含量以眼鏡蛇毒中含量較高，從眼鏡蛇毒中分離出的NT具有長短鏈兩種，其中以 短鏈NT鎮痛效果更好。 科博肽系從湖南眼鏡蛇（NajaNajaAtra)蛇毒中分離純化的短鏈NT，是由68個 氨基酸組成的單鏈多肽，四個二硫鍵維系其空間結構，分子量為7000道爾頓左右，適用于 晚期癌癥疼痛、慢性關節痛、坐骨神經痛、神經性頭痛、三叉神經痛、麻風反應神經痛等慢性 疼痛的治療，尤其用于慢性、頑固性、持續性疼痛的治療，現臨床使用為肌注給藥和口服復 方制劑（科博肽、曲馬多和布洛芬的組合物）給藥。 蛇毒中成分復雜，其中蛋白質占干重的90%，包括5-15種酶、3-12種非酶性蛋白 質或多肽，另含5-20%小分子肽、氨基酸、糖類、脂類等等。眼鏡蛇毒中已經研究確定的成分 有膜活性多肽、神經毒素、神經生長因子、溶血素（DLP)、CVA蛋白、眼鏡蛇毒因子等及其他 成分，如堿性磷酸單酯酶、磷酸二酯酶、乙酰膽堿酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白 水解酶等。目前，眼鏡蛇神經毒素和科博肽的提取，主要使用鹽析（硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂 等中性鹽）、陽離子柱層析、親和層析等方法組合提取。其存在的缺陷主要有：鹽析沉淀經 過蛋白變性、復性的過程，雜蛋白共沉淀比較多，活性蛋白損失大，在蛇毒處理過程中，價格 昂貴的蛇毒資源損失嚴重；親和層析填料制備困難，使用條件苛刻，大規模長期使用親和填 料容易被蛇毒雜蛋白質毒化、重現性差；陽離子柱層析只對某些類型的堿性蛋白酶、多肽、 核酸類雜蛋白能夠按目標蛋白分子所載電荷實施有效分離，但是對于蛇毒中復雜的其他成 分或電荷相差不大的蛋白酶、多肽的分離提取存在很大的局限性，部分研究得到的神經毒 素和科博肽純度只達到SDS-PAGE電泳純。因此，從眼鏡蛇毒中有效、穩定、重現性好的提取 高純度的神經毒素和科博肽是一項復雜困難的工作。 現有國家藥品質量標準中對單組份生物、生化藥品的純度要求通常為：SDS-PAGE 電泳一條帶或HPLC含量大于90 %，如科博肽國家藥品標準（WS1-XG-009-2000)、或降纖酶 國家藥品標準（WS1-XG-031-2000) ;HPLC含量大于95%或更高的的生物、生化單組份的高 純度的藥物意味著制劑中與治療作用無關的雜物質含量更少，這對于保證藥品的質量、療 效、改善藥物作用的時效、減少藥物的毒副反應都具有重要意義。 科博肽國家藥品標準（WS1-XG-009-2000)規定要求：按干燥品計算，神經毒蛋白 含量不得少于35.0% ;HPLC純度檢查主峰相對百分含量不得少于90.0%。而藥品原料的 含量和純度，在保證藥品質量、療效、安全性、用藥劑型等方面具有決定作用。現有市售科博 肽產品，存在原料批次間含量和純度相對低、臨床療效不穩定、起效時間慢（陳汝筑，吳秀 榮.眼鏡蛇神經毒素的鎮痛作用[J].中國藥理學通報，1988,4(2) :113.實驗動物注射眼 鏡蛇神經毒素后2小時，大鼠痛閾顯著上升，3小時后達到較佳效果，NT鎮痛作用起效慢，但 維持時間長。陳燕，許云祿.舟山眼鏡蛇神經毒素的分離純化及鎮痛作用研究[J].海峽藥 學，2007,19(12) :27.小鼠動物實驗顯示，給藥后2小時起效，4小時作用達峰值。朱天新， 袁彩君，任晚瓊.眼鏡蛇神經毒素的規模化制備及其鎮痛作用的研究[J].華西藥學雜志， 2007, 22 (3) :247?249.小鼠熱板試驗、大鼠電撕叫試驗和小鼠扭體試驗結果基本一致， 顯示CNT具有較強的鎮痛作用，且具有起效緩慢的特點）、科博肽單方制劑只可肌肉注射給 藥、病人用藥順應性差等缺陷。 市售口服含科博肽的鎮痛藥只有復方制劑--克洛曲片，該藥品由科博肽、鹽酸 曲馬多和布洛芬按1 : 150 : 300配比組成，其組分為：每片含科博肽按神經毒蛋白計為 160μg，含鹽酸曲馬多（C16H25NO2 ·Ηα)25π^，含布洛芬（C13H18O2) 50mg;其中科博肽主要通過 抑制乙酰膽堿的釋放而起鎮痛作用；鹽酸曲馬多通過與中樞的阿片受體結合而發揮鎮痛作 用；布洛芬通過抑制環氧化酶而起鎮痛作用；三者通過不同的作用機理發揮鎮痛的協同作 用；但是由于病人的個體差異和個體病人體內生理生化指標和病灶的復雜性，復方制劑中 藥物之間的相互作用也會引起一些與預期治療目標相悖的副作用，存在一定的用藥風險和 用藥局限性。為了規避復方制劑的用藥風險，按照病人的個體狀況，醫生處方按照單方制劑 聯合用藥也是一種醫療方案的上佳選擇和需求。
技術實現思路
本專利技術申請所要解決的一個技術問題是提供一種新的高純度神經毒素（包括科 博肽）的提取方法，該方法工藝穩定、層析填料易得、綜合成本低、操作條件適應性好、神經 毒素（包括科博肽）的收率高。 本專利技術申請進一步解決的技術問題是提供一種由上述方法制備得到的高純度科 博肽，用它制成的注射用科博肽制劑中與治療作用無關的雜質少、治療作用起效快、療效穩 定。 本專利技術申請還進一步解決的技術問題是提供幾種以高純度科博肽為有效成分，配 方制成制劑所必要的制劑輔料的藥物組合物及不同的劑型，適合口服、口腔吸收、直腸給藥 的科博肽制劑。 本專利技術申請考慮到眼鏡蛇蛇毒成分的復雜性和科博肽為堿性多肽、分子量大約 7000道爾頓左右、相對耐熱耐酸堿等理化性質，綜合考慮各種層析柱填料的分離機理、應用 特點、長期使用的穩定性、成本的可控性以及提取目標的達成，提供一種高純度科博肽的提 取方法，所述提取方法概括如下： 1.分離和純化科博肽：根據各種填料在寬PH范圍內的穩定性、離子化程度、載樣 量、與目標蛋白科博肽的吸附力強弱以及分辨率，使用SP陽離子柱層析高通量捕獲目標蛋 白-科博肽，使用CM陽離子柱層析精細純化科博肽； 2.進一步使用Sephadex凝膠過濾柱層析按分子量大小精細純化科博肽，使用 DEAE陰離子交換柱層析去除微量殘留的雜蛋白、酶類（例如酸性蛋白酶類、蛋白水解酶、絲 氨酸蛋白酶類等）得到高純度的科博肽和神經毒素； 3.按照上述純化方法得到的科博肽神經毒蛋白含量達到50%以上，HPLC純度 達到96%以上、最高達到100% ;科博肽總收率達到3. 7%，而鹽析預處理方案總收率 2. 5-2. 6% ； 4.得到的高純度科博肽經動物實驗口服、注射給藥均具有顯著的鎮痛效果，藥效 起效時間短，鎮痛作用維持時間長。 具體來說，所述高純度科博肽的提取方法本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高純度科博肽的提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：1)取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，。室溫或低溫離心，取上清液，待上柱層析；2)取上清液，上SP?Sepharose?FF陽離子柱層析，用NaAC?HAC、Tris?HCl或磷酸鹽緩沖液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或Tris?HCl緩沖液在低溫透析后待上樣；3)將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellulose陽離子柱層析，用含NaCl的磷酸鹽緩沖液或Tris?HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液低溫透析后待上樣；4)將步驟3)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAE?Sepharose?FF陰離子柱層析，用磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組分，收集液用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液低溫透析后，把透析液裝入阻斷分子量為5000的透析袋中，用聚乙二醇8000包埋濃縮待上樣；5)將步驟4)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣Sephadex?G?50凝膠過濾柱層析，用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用NaCl溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機中抽真空凍干，得到高純度的科博肽；或所述的高純度科博肽的提取方法，包括下述步驟：1)取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，離心，取上清液，待上柱層析；2)取上清液，上SP?Sepharose?FF陽離子柱層析，用NaAC?HAC、Tris?HCl或磷酸鹽緩沖液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或Tris?HCl緩沖液在低溫透析后待上樣；3)將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellulose陽離子柱層析，用含NaCl的磷酸鹽緩沖液或Tris?HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液在低溫透析、濃縮后待上樣，4)將步驟3)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣Sephadex?G?50凝膠過濾柱層析，用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液低溫透析后待上樣；5)將步驟4)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAE?Sepharose?FF陰離子柱層析，用含NaCl的磷酸鹽或Tris?HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組分，收集液用NaCl溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機中抽真空凍干，得到高純度的科博肽。...

【技術特征摘要】
1. 一種高純度科博肽的提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟： 1) 取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，。室溫或低溫離心，取上清液，待 上柱層析； 2) 取上清液，上SP S印harose FF陽離子柱層析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖 液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩 沖液在低溫透析后待上樣； 3) 將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，用含NaCl的 磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液 用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后待上樣； 4) 將步驟3)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAE S印harose FF陰離子柱層析，用磷酸 鹽或Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組分，收集液用 含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后，把透析液裝入阻斷分子量為5000的透析 袋中，用聚乙二醇8000包埋濃縮待上樣； 5) 將步驟4)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用NaCl 溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機中抽真空凍干，得到高純度 的科博肽； 或 所述的高純度科博肽的提取方法，包括下述步驟： 1) 取眼鏡蛇粗毒溶解于蒸餾水或含NaCl的緩沖液中，離心，取上清液，待上柱層析； 2) 取上清液，上SP S印harose FF陽離子柱層析，用NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖 液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液用磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩 沖液在低溫透析后待上樣； 3) 將步驟2)收集的科博肽組分溶液，上樣CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，用含NaCl的 磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液進行直線梯度洗脫，按記錄譜圖收集科博肽組分，收集液 用含NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液在低溫透析、濃縮后待上樣， 4) 將步驟3)收集的科博肽組分濃縮溶液，上樣S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液洗脫，收集記錄譜圖最大峰即科博肽組分，收集液用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液低溫透析后待上樣； 5) 將步驟4)收集的科博肽組分溶液，上樣DEAE S印harose FF陰離子柱層析，用含 NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液進行線性梯度洗脫，收集記錄譜圖的最大峰即科博肽組 分，收集液用NaCl溶液低溫透析，所得的科博肽組分溶液過濾除菌，在冷凍干燥機中抽真 空凍干，得到高純度的科博肽。2. 根據權利要求1所述的高純度科博肽的提取方法，其進一步特征在于： 1) 眼鏡蛇粗毒溶液濃度為0. 05-0. 2g/ml，溶解緩沖液為10-100mm〇l/L PH 4. 0-8. 5含 0? 45% -0? 9% (W/V% )濃度 NaCl 的 NaAC-HAC、Tris-HCl 或磷酸鹽緩沖液； 2. SP Sepharose FF陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 4. 0-8. 55_50mmol/L的 NaAC-HAC、Tris-HCl或磷酸鹽緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-1. 0m〇l/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 5-8. 5,濃度0. 0-0. 20mol/L NaC15-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液，透析 參數為4-10°C低溫透析4-8小時； 3. CM52Cellul〇Se陽離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 5-8. 55-50mmol/L的磷酸鹽緩沖 液或Tris-HCl緩沖液，洗脫鹽梯度為0. 0-0. 80mol/L NaCl ;透析緩沖液為PH 5. 0-7. 5,鹽 濃度0. 0-0. 15mol/L NaCl 5-50mmol/L的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數為4-10°C低 溫透析4-8小時； 4. DEAE S印harose FF陰離子柱層析，洗脫緩沖液為PH 5. 0-7. 55-50mmol/L的磷酸鹽 或Tris-HCl緩沖液。洗脫鹽梯度為0. 00-0. 80mol/L NaCl，透析緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃 度為0. 0-0. 50mol/L NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透析參數為4-10°C低溫透析4-8 小時； 5. S印hadex G-50凝膠過濾柱層析，洗脫緩沖液為PH 6. 0-8. 0,鹽濃度為 0. 0-0. 50mol/L NaCl的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液，透...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張慶宇，
申請(專利權)人：張慶宇，
類型：發明
國別省市：北京;11