一種提高綿羊卵母細胞體外發育能力的方法技術

本發明專利技術提供的一種提高綿羊卵母細胞體外發育能力的方法，將染色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，體外成熟、體外受精后用含有200nMol/L組蛋白去乙酰化抑制劑曲古抑菌素A(TSA)培養液培養10h，用不含有TSA的培養液繼續培養，培養48h后統計卵裂率，培養7d后統計囊胚率即可，另將染色分離獲取的BCB+卵母細胞用成熟培養液洗滌2-3次，培養至24h直接利用。該法對綿羊卵母細胞體外利用，具有重要的實用價值。

【技術實現步驟摘要】
一種提高綿羊卵母細胞體外發育能力的方法
本專利技術涉及組蛋白去乙酰化抑制劑曲古抑菌素A(TSA)，對經過BCB篩選后的質量不好的BCB陰性卵母細胞進行培養的方法，能顯著提高綿羊卵母細胞體外胚胎發育率。
技術介紹
TSA是一種非競爭性可逆的組蛋白乙酰化抑制劑，其來源于鏈霉素的代謝產物，它的主要作用是增強組蛋白的乙酰化水平。TSA可以特異性抑制組蛋白去乙酰化酶的活性，降低DNA甲基化水平并激活印記基因和管家基因的表達。而組蛋白的高乙酰化水平可以增強轉錄因子與核小體的作用，有利于基因轉錄的啟動。當組蛋白乙酰化作用達到高峰時胚胎的基因組被激活，并與基因表達水平的增加相一致。因此，組蛋白去乙酰化抑制劑TSA可能會對綿羊卵母細胞及體外胚胎的發育能力產生影響。在前期研究的一種用于綿羊卵母細胞體外的篩選培養方法(專利號：ZL200910113567.9)中發現，經過BCB篩選后的陰性卵母細胞成熟率極顯著低于陽性卵母細胞，因而，如何提高陰性卵母細胞質量成為亟待解決的問題。文獻檢索披露：1.ReprodFertDev，2007，19(1)，169，作者：ZhangYH等，發表的《TSA優化處理的克隆胚胎體外培養體系可以得到克隆小豬》文章得出，50nM的TSA能提高豬克隆胚胎體外培養的囊胚率。2.Zygote，2009，17，209-215，作者：ShuntaroIkeda等，發表的《在牛的卵母細胞體外受精過程中通過TSA增加組蛋白乙酰化水平影響囊胚的內細胞團數》文章得出，在牛的卵母細胞體外受精過程中經TSA處理后，顯著提高了囊胚內細胞團數。3.ReprodDev，2011，57(1)：34-42，作者：LeeMJ等，發表的《TSA提高了牛體細胞核移植胚胎的發育》文章得出，TSA處理牛克隆胚胎，可以顯著提高牛體細胞核移植的效率。國內有中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所劉曉等8人發表的《曲古抑菌素A對豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎發育能力的影響》、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所李向臣等5人發表的《TSA對灘羊成纖維細胞作為供體細胞的作用》、東北農業大學生命科學學院黃波等5人發表的《TSA濃度及處理時間對豬體細胞核移植胚胎體外發育影響》。本專利技術將TSA與BCB篩選技術相結合作為本方法的切入點，展開的方法學與應用學的研究，能極大地提高綿羊卵母細胞體外發育能力，具有重要的實踐意義。
技術實現思路
本專利技術的目在于：為提高綿羊卵母細胞的質量，即先采用BCB染色篩選，再對篩選后的質量差的卵母細胞用TSA進行抑制培養，效果十分明顯，該方法簡單易操作，實用性極強。本專利技術的目的是這樣實現的：一種提高綿羊卵母細胞體外發育能力的方法，分步實施；步驟1：將染色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，用成熟培養液洗滌2-3次，按25-30枚/滴，放入前2h平衡好的體積為55-78μl/滴的成熟培養液中，放入CO2箱，在5％CO2、95％的空氣條件下培養；步驟2：將步驟1體外成熟23-25h的卵母細胞取出，用0.1％的透明質酸酶處理30-60s，經吹吸，脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞；用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2h平衡好的50-70μl的體外受精液滴內；水浴解凍精液，移入前2h平衡好的裝有體外受精液的試管，放入CO2箱，上游20-25min，取上清，在1500rpm條件下，離心4-5min，棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按2-4×106個/ml的密度加入體外受精液滴，與處理好的卵母細胞共同孵育；步驟3：將步驟2受精20-23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的體外培養液內，經吹吸，脫去卵丘細胞及黏附卵上的精子，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的含有TSA的體外培養液內培養10h，再用不含TSA的體外培養液洗滌2-3次，放置于不含TSA的體外培養液內培養7d，統計囊胚率；其中BCB-卵母細胞的獲取：摘取宰殺30min內的綿羊卵巢，置入溫度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3h內用生理鹽水清洗3-4次，用吸有1ml抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡，將注射器內回收的卵泡液打在35-60mm的皿內，在顯微鏡下撿出卵母細胞，放入添加濃度為25-30μMol/L的BCB染色液，置于35-39℃水浴中染色80-90min，在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細胞分離，其中將染色分離的BCB+卵母細胞，用成熟培養液洗滌2-3次，培養至24h，直接利用；步驟4：實驗液體的配制：抽卵液：TCM-199hepes+1mg/mlPVA+0.7mg/ml肝素鈉；亮甲酚藍染色液：PBS+26μMol/L亮甲酚藍+5mg/mlBSA；成熟培養液：TCM-199HCO3+10％FBS+0.05IU/mlFSH+0.05IU/mlLH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mlEGF+100IU/ml雙抗；SOF：6.29mg/mlNaCL+0.534mg/mlKCL+0.162mg/mlKH2PO4+0.6μl/ml乳酸鈉+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；體外受精液：SOF+20％FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml硫酸慶大霉素；體外培養液：SOF+3mg/mlBSA；含TSA體外培養液：SOF+200nMol/LTSA+3mg/mlBSA。本專利技術在前期的研究中，已經驗證了亮甲酚藍染色(BCB)(專利號：ZL200910113567.9)可用于測定G6PDH活性，根據G6PDH活性的不同，BCB染色呈現不同程度的著色；并且發現BCB-卵母細胞體外培養的成熟率、卵裂率、囊胚率顯著低于BCB+組，因此采用TSA與BCB篩選技術相結合；就是將BCB-卵母細胞使用添加TSA的培養液作用10h，能提高BCB-卵母細胞質量，而BCB+卵母細胞質量不受任何影響，從而能提高卵母細胞總體發育效率。本專利技術的構思及研究機理表明，添加曲古抑菌素A能顯著提高經BCB篩選后的質次BCB-卵母細胞體外培養囊胚發育率。采用TSA與BCB篩選技術相結合的技術路線科學合理，組合方法達到了創新效果，且有獨到之處，彰顯技術進步。具體實施方式本專利技術結合實施例作進一步說明。實施例、將染色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，用成熟培養液洗滌3次，按28枚/滴，放入前2h平衡好的體積為60μL/滴的成熟培養液中，放入CO2箱，在5％CO2、95％的空氣條件下培養；將體外成熟24h的卵母細胞取出，用0.1％的透明質酸酶處理45s，經吹吸，脫去部分卵丘細胞；用體外受精液洗滌3次，按28枚/滴的密度加入前2h平衡好的60μL的體外受精液滴內；水浴解凍精液，移入前2h平衡好的裝有體外受精液的試管，放入CO2箱，上游23min，取上清，在1500rpm條件下，離心5min，棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按3×106個/mL的密度加入體外受精液滴，與處理好的卵母細胞共同孵育；將受精21h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的體外培養液內，經吹吸，脫去全部卵本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提高綿羊卵母細胞體外發育能力的方法，其特征在于：分步實施;步驟1將染色分離獲取的質次BCB?卵母細胞，用成熟培養液洗滌2?3次，按25?30枚/滴，放入前2h平衡好的體積為55?78μl/滴的成熟培養液中，放入CO2箱，在5%?CO2、95%的空氣條件下培養；步驟2將步驟1體外成熟23?25h的卵母細胞取出，用0.1%的透明質酸酶處理30?60s，經吹吸，脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞；用體外受精液洗滌2?4次，按25?30枚/滴的密度加入前2h平衡好的50?70μl的體外受精液滴內；水浴解凍精液，移入前2h平衡好的裝有體外受精液的試管，放入CO2箱，上游20?25min，取上清，在1500rpm條件下，離心4?5min，棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按2?4×106個/ml的密度加入體外受精液滴，與處理好的卵母細胞共同孵育；步驟3將步驟2受精20?23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的體外培養液內，經吹吸，脫去卵丘細胞及黏附卵上的精子，洗滌3?4次，按50?70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的含有TSA的體外培養液內培養10h,再用不含TSA的體外培養液洗滌2?3次，放置于不含TSA的體外培養液內培養7d，統計囊胚率；其中BCB?卵母細胞的獲取：摘取宰殺30min內的綿羊卵巢，置入溫度在30?35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3h內用生理鹽水清洗3?4次，用吸有1ml抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2?8mm的卵泡，將注射器內回收的卵泡液打在35?60mm的皿內，在顯微鏡下撿出卵母細胞，放入添加濃度為25?30μMol/L的BCB染色液，置于35?39℃水浴中染色80?90min，在顯微鏡下將BCB+和BCB?卵母細胞分離，其中將染色分離的BCB+卵母細胞，用成熟培養液洗滌2?3次，培養至24h，直接利用；步驟4實驗液體的配制：抽卵液：TCM199hepes+1mg/ml?PVA+0.7?mg／ml肝素鈉；亮甲酚藍染色液：PBS+26μMol/L亮甲酚藍+?5mg/ml?BSA；成熟培養液：TCM199HCO3+10%FBS+0.05IU/ml?FSH+0.05IU/ml?LH+1μg/ml?estradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L?半胱氨酸+10ng/ml?EGF+100IU/ml雙抗；SOF：6.29mg/ml?NaCL?+0.534?mg/ml?KCL+0.162?mg/ml?KH2PO4+0.6μl/ml乳酸鈉+0.089mg/ml?MgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；體外受精液：SOF+20%FBS?+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml硫酸慶大霉素；體外培養液：SOF+3mg/mlBSA；含TSA體外培養液：SOF+200nMol/L?TSA+?3mg/mlBSA。...

【技術特征摘要】
1.一種提高綿羊卵母細胞體外發育能力的方法，其特征在于：分步實施：步驟1、將染色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，用成熟培養液洗滌2-3次，按25-30枚/滴，放入前2h平衡好的體積為55-78μL/滴的成熟培養液中，放入CO2箱，在5％CO2、95％的空氣條件下培養；步驟2、將步驟1體外成熟23-25h的卵母細胞取出，用0.1％的透明質酸酶處理30-60s，經吹吸，脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞；用體外受精液洗滌2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2h平衡好的50-70μL的體外受精液滴內；水浴解凍精液，移入前2h平衡好的裝有體外受精液的試管，放入CO2箱，上游20-25min，取上清，在1500rpm條件下，離心4-5min，棄去上清液，將剩余的精子沉淀，按2-4×106個/mL的密度加入體外受精液滴，與處理好的卵母細胞共同孵育；步驟3、將步驟2受精20-23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的體外培養液內，經吹吸，脫去卵丘細胞及黏附卵上的精子，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μL/孔的含有TSA的體外培養液內培養10h,再用不含TSA的體外培養液洗滌2-3次，放置于不含TSA的體外培養液內培養7d，統計囊胚率；其中BCB-卵母細胞的獲取：摘取宰殺30min內的綿羊卵巢，置入溫度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3h內用生理鹽水清洗3-4...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃俊成，汪立芹，楊楠，林嘉鵬，吳陽升，趙云程，
申請(專利權)人：新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國澳大利亞綿羊育種研究中心，
類型：發明
國別省市：新疆;65