紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法技術

紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法：⑴.含表皮、真皮結構人工皮膚的構建；將人皮膚成纖維細胞重懸于膠原蛋白溶液滴加至細胞培養孔板培養；細胞完全展開滴加人角質形成細胞懸液至膠原凝膠表面繼續培養；凝膠表面人角質形成細胞完全鋪滿時進行氣液面培養；角質層分化至5-8層停止培養；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測定。本發明專利技術構建的人工皮膚成為角蛋白酶產生的天然誘導劑；具有以下優點：一、人工皮膚含有真皮層、表皮層及5-8層的角質層，結構和功能更接近人體皮膚；二、表皮層角質形成細胞分泌的角蛋白作為天然底物誘導角蛋白酶的產生；三、由天然底物角蛋白誘導產生的角蛋白酶，其活性測定更準確、更真實、更穩定。

【技術實現步驟摘要】
紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法
本專利技術涉及一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，屬于真菌微生物

技術介紹
皮膚癬菌是指能入侵角質層和角質組織，引起人和動物皮膚、毛發和甲感染的真菌。目前發現大約有40余種皮膚癬菌，其中的30余種有致病性。常引起感染的皮膚癬菌主要有紅色毛癬菌，須癬毛癬菌，犬小孢子菌，石膏小孢子菌和絮狀表皮癬菌。紅色毛癬菌是引起皮膚癬菌病最常見的致病菌，據統計可導致皮膚癬菌病90%的慢性難治性感染。與其他感染性疾病相同，皮膚癬菌病的發病是真菌毒力因子與宿主屏障結構和免疫系統相互作用的結果。通常認為與角蛋白降解有關的酶是皮膚癬菌病致病菌的重要毒力因子。但是，角蛋白酶的產生需要底物的誘導，現有研究及相關的技術體系需要采用特殊培養基，如沙堡培養基、蛋白胨培養基、含皮屑培養基、含甲培養基等誘導角蛋白酶的產生。臨床上紅色毛癬菌感染人體時并不存在上述誘導物，以誘導產生的方式研究紅色毛癬菌重要的毒力因子角蛋白酶致病機理可能存在嚴重偏差。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法。該方法是為了模擬人體皮膚的組織結構與基本功能且反映紅色毛廯菌臨床上粘附、感染并致病的大體過程，從而構建了含表皮、真皮結構的人工皮膚，該人工皮膚含有分化良好的角質層，成為角蛋白酶產生的天然誘導劑。為今后揭示紅色毛廯菌導致機體發病的機理提供更真實、更準確的方法。本專利技術采用的技術方案如下：一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：⑴.含表皮、真皮結構人工皮膚的構建；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測定。以上所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，具體操作步驟是：⑴.含表皮、真皮結構人工皮膚的構建：a.無菌操作條件下，將人皮膚成纖維細胞重懸于膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養孔板，放置于細胞培養箱培養；b.顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加人角質形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續置于細胞培養箱培養；c.顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養；d.之后每天進行冷凍切片HE染色，當角質層分化至5-8層時，停止培養；即得含表皮、真皮結構的人工皮膚；⑵.紅色毛癬菌的人工感染：將培養的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調整為1個麥氏濃度（106個孢子/ml），滴加5μl至步驟⑴制備的含表皮、真皮結構的人工皮膚，繼續培養48h；HE染色驗證紅色毛癬菌是否成功感染人工皮膚；⑶.角蛋白酶活性的測定：收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養液，以天青角蛋白為底物，按照試劑盒說明書操作測定角蛋白酶的活性。為了模擬人體皮膚的組織結構與基本功能且反映紅色毛廯菌臨床上粘附、感染并致病的大體過程，本專利技術構建了含表皮、真皮結構的人工皮膚，該人工皮膚含有分化良好的角質層，成為角蛋白酶產生的天然誘導劑。本專利技術的核心創新在于：創造性的引入人體角蛋白作為角蛋白酶的誘導底物，而角蛋白哪里來的呢？是通過我們構建人工皮膚時自然產生的。這一核心創新點，與目前所有研究均不同，以前的研究集中在動物模型或者是用培養基誘導角蛋白酶的產生。本專利技術的核心是模擬一種更準確、更真實模擬紅色毛廯菌感染人體皮膚的過程，即用來自人體細胞且與人體皮膚有同樣結構的角蛋白作為角蛋白酶的誘導底物。本專利技術具有以下優點：一、人工皮膚含有真皮層、表皮層，特別是5-8層的角質層，在結構和功能上更接近人體皮膚；二、表皮層角質形成細胞分泌的角蛋白作為天然底物誘導角蛋白酶的產生；三、由天然底物角蛋白誘導產生的角蛋白酶，其活性的測定更準確、更真實、更穩定。例如，在實施例中，A595nm較陰性對照每改變0.01相當于1U角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13U。具體實施方式為進一步說明本專利技術，結合一下實施例具體闡述。實施例1：無菌操作條件下，將106個人皮膚成纖維細胞重懸于2ml膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養6孔板，放置于37℃、5%CO2的細胞培養箱培養。3d后顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加106個人角質形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續置于細胞培養箱培養。5d后顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養。之后每天進行冷凍切片HE染色，10d后角質層分化至5-8層時，停止培養。即得含表皮、真皮結構的人工皮膚（見圖1）。實施例2：將培養的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調整為1個麥氏濃度（106個孢子/ml），滴加5μl至步驟⑴制備的含表皮、真皮結構的人工皮膚，繼續培養48h。HE染色驗證紅色毛癬菌成功感染人工皮膚（見圖2）。實施例3：收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養液約4ml，4000rpm15min，吸出上清液3ml轉移入2ml含5mg的keratin-azure的緩沖液，將其放入30℃200rpm搖床孵育。用3ml無菌水代替上清液作為陰性對照。72小時后，將反應上清液置于冰板上，吸取上清液1ml，4℃12000rpm離心5min。將上清液吸取至96孔板，每孔200μl，重復3孔，用紫外分光光度計測定A595nm的OD值，以無菌水含等量keratin-azure的空白液為陰性對照。A595nm較陰性對照每改變0.01相當于1U角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13U。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，包括以下步驟：⑴.含表皮、真皮結構人工皮膚的構建；⑵.紅色毛癬菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的測定。

【技術特征摘要】
2014.08.06 CN 201410385246.51.一種紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，具體操作步驟如下：⑴.含表皮、真皮結構人工皮膚的構建：a.無菌操作條件下，將人皮膚成纖維細胞重懸于膠原蛋白溶液，滴加至細胞培養孔板，放置于細胞培養箱培養；b.顯微鏡下觀察到細胞完全展開，滴加人角質形成細胞懸液至膠原凝膠表面，繼續置于細胞培養箱培養；c.顯微鏡下觀察到凝膠表面人角質形成細胞完全鋪滿時，進行氣液面培養；d.每天進行冷凍切片HE染色，當角質層分化至5-8層時，停止培養；即得含表皮、真皮結構的人工皮膚；⑵.紅色毛癬菌的人工感染：將培養的紅色毛癬菌重懸于生理鹽水，調整為1個麥氏濃度，滴加5μl至步驟⑴制備的含表皮、真皮結構的人工皮膚，繼續培養48h；HE染色驗證紅色毛癬菌是否成功感染人工皮膚；⑶.角蛋白酶活性的測定：收集步驟⑵感染紅色毛癬菌的人工皮膚的培養液，以天青角蛋白為底物，按照試劑盒說明書操作測定角蛋白酶的活性。2.根據權利要求1所述的紅色毛癬菌角蛋白酶活性的測定方法，其特征在于，各步驟的具體操作方法是：⑴.含表皮、真皮結構人工皮膚的構建：a.無菌操作條件下，將106個人皮膚成纖維細胞重懸于2ml膠原蛋白...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉維達，馬鵬程，曹玉萍，沈永年，
申請(專利權)人：中國醫學科學院皮膚病研究所，
類型：發明
國別省市：江蘇;32