本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，本發(fā)明專利技術(shù)本發(fā)明專利技術(shù)針對ORF1基因就PCV1和PCV2的ORF1閱讀框同源性高達(dá)86%進(jìn)行核酸疫苗研究，可刺激動物機體產(chǎn)生相應(yīng)高水平的抗體，體現(xiàn)出很強的特異性，針對PCV1和PCV2引發(fā)豬的感染和傳播，通過兩種病毒類似的閱讀框?qū)煞N病毒起到防控效果，可達(dá)到安全和有效的效果。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，尤其是一種。
技術(shù)介紹
豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV)為圓環(huán)病毒科（Circoviridae)圓環(huán)病毒 屬成員，單股環(huán)狀DNA病毒，為已知的最小動物病毒之一。根據(jù)基因組和抗原性的差異，分 為PCVl和PCV2兩種基因型（或血清型），其中PCVl至今未發(fā)現(xiàn)有致病性，PCV2則被認(rèn)定 是導(dǎo)致仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS) 的主要病原。PCV2常與細(xì)小病毒（PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬肺炎支原 體、偽狂犬病毒（PRV)混合感染，造成豬的免疫失敗。PCVl和PCV2的基因組包含有2個主 要的開放閱讀框，即ORFl和0RF2,病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白由0RF2編碼，ORFl基因編碼Rep和 較小的^兩種與復(fù)制有關(guān)的蛋白。將體外表達(dá)的ORFl編碼蛋白與表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞集落刺激因子（GM2CSF)的真核表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合免疫豬群，能起到抵抗PCV2攻擊的作用，這 提示針對ORFl基因編碼蛋白的抗體可能具有中和病毒的作用。PCVl與PCV2的ORFl閱讀 框同源性高達(dá)86%，目前大多數(shù)報道稱PCVl無致病性，但已有報道稱其可引起繁殖障礙，豬 圓環(huán)病毒的免疫程序已經(jīng)很成熟，但其帶來的經(jīng)濟損失卻持續(xù)增加，可以很好的解釋PCVl 的存在對PCV2的致病性有促進(jìn)作用。 目前，國內(nèi)外對于PCV2基因工程疫苗包括PCV2亞單位疫苗和重組PCV2活載體疫 苗。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護(hù)性抗原，能刺激動物機體產(chǎn)生針對PCV2 的特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亞單位 疫苗生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要是昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。其中重組PCV2活載體疫苗又包 括PCV2病毒活載體疫苗和PCV2細(xì)菌活載體疫苗。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是：提供一種，它所制備或的 疫苗能有效預(yù)防PCVl及PCV2的感染與傳播，可達(dá)到很好的免疫效果，而不產(chǎn)生致病性，并 體現(xiàn)出很強的特異性，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。 本專利技術(shù)是這樣實現(xiàn)的：，包括如下步驟 1) 將豬圓環(huán)病毒II型ORFl基因進(jìn)行PCR擴增，豬圓環(huán)病毒II型ORFl基因具有如序列 表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，擴增條件為：PCR體系總體積50 μ L，其中CldH2O 為 37 μ L，IOXPCR Buffer 5 μ L，dNTP LO μ L，上下游引物各 LO μ L，DNA 模板 4.0 μ L， Taq酶1.0 yL;擴增程序為：94°C預(yù)變性3min;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸 I. 5min，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后延伸72°C IOmin ;上游引物的序列為Primer F 5' -CGGGT ACCATGCCCAGCAAGAAGAATG-3'，下游引物的序列為 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITT CATATGGAA-3;； 2) 將擴展獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，在37°C下培養(yǎng)12 h，挑取上述白色菌落，接種到含有氨芐青霉素的2XYT液體 培養(yǎng)基中，在37°C振蕩培養(yǎng)過夜至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定； 3) 將重組質(zhì)粒PMD18-0RF1與pEGFP-Cl載體分別進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，回收純化 目的片段，將二者用T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，用試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，用試劑盒提取獲得陽性重組質(zhì) 粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1，并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定； 4) 真核構(gòu)建體系為：目的DNA片段8yL、pEGFP-Cl 2yL、T4 DNA ligase0.5yL、10XT4 DNA ligase buffer I. 5 μ L、滅菌 ddH20 3· O μ L，總體積 15. O μ L ; 5) 培養(yǎng)并收獲處于指數(shù)生長期的ΡΚ-15細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL營養(yǎng)液懸浮細(xì) 胞；然后取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加 I mL上述細(xì)胞懸液和I mL生長液，放入37°C 5%C02恒溫 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)709Γ80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofecttamine TM2000試劑說 明書進(jìn)行重組質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- ORFl轉(zhuǎn)染試驗；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，檢測轉(zhuǎn)染水平， 同時設(shè)置轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-Cl和不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為對照。 6)經(jīng)擴增培養(yǎng)后，獲得的pEGFP-Cl- PCV2- ORFl質(zhì)粒作為基于豬圓環(huán)病毒核酸疫 苗。 本專利技術(shù)將針對PCVl的存在對PCV2的致病性有促進(jìn)作用這一問題設(shè)計了疫苗，用 于預(yù)防并控制PCVl和PCV2對豬的感染，適用于對豬的免疫，為豬圓環(huán)病毒病的防治提供安 全有效的免疫產(chǎn)品，并減少對養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟損失。本專利技術(shù)安全性好，針對豬圓環(huán)病毒其 中一個重要的閱讀框展開研發(fā)，通過對豬制定合理的免疫程序，從而達(dá)到對豬圓環(huán)病毒病 的預(yù)防與控制，可達(dá)到很好的免疫效果，而不產(chǎn)生致病性；本專利技術(shù)針對ORFl基因就PCVl和 PCV2的ORFl閱讀框同源性高達(dá)86%進(jìn)行核酸疫苗研究，可刺激動物機體產(chǎn)生相應(yīng)高水平的 抗體，體現(xiàn)出很強的特異性；本專利技術(shù)針對PCVl和PCV2引發(fā)豬的感染和傳播，通過兩種病毒 類似的閱讀框?qū)煞N病毒起到防控效果，有很好的科學(xué)性。 【附圖說明】 附圖1為本專利技術(shù)的流程圖。 【具體實施方式】 本專利技術(shù)的實施例：： 真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl- PCV2- 0RF1、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、無內(nèi)毒素質(zhì)粒 抽提相關(guān)試劑等。 包括如下步驟： 第一，引物的設(shè)計及合成 引物經(jīng)登錄661161^111^(?^￥.11(313；[.111111.11；[11.80￥)獲取3/?-321株（登錄號疋11747085)、 Vos_2689006 株（登錄號：EUM555I)、Ρ701-1 株（登錄號：FJ905468)、PCV2_HZ0 20l 株（登 錄號：AY-188355)和PCV2herd D株（登錄號：EU136720)序列，以Bioedit軟件比對選取保 守序列后經(jīng)Primer Premier 5軟件設(shè)計豬圓環(huán)病毒II型ORFl基因（具有如序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列)通用引物；上游引物的序列為Primer F 5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，，下游引物的序列為 PrimerR 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA _3' ； 第二，最佳反應(yīng)體系的確定 PCR 體系總體積 50yL，其中 ddH20 37yL，10XPCR Buffer 5yL，dNTP LOyL，上下 游引物各I. 0μ L，DNA模板4. 0 μ L，Taq酶I. 0 μ L。擴增程序為：94°C預(yù)變性3min ;94°C 變性45s，55°C退本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，其特征在于：包括如下步驟1）將豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1基因進(jìn)行PCR擴增，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1基因具有如序列表中SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，擴增條件為：PCR體系總體積50μL，其中ddH2O為37μL，10×PCR?Buffer?5μL，dNTP?1.0μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板4.0?μL，Taq酶1.0?μL；擴增程序為：94℃?預(yù)變性3min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后延伸72℃?10min；上游引物的序列為5′?CGGGTACCATGCCCAGCAAGAAGAATG?3，下游引物的序列為5′?GGCCCGGGTCAGTAATTTATTTCATATGGAA?3′；2）將步驟1）中獲得的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量百分比為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的條帶的凝膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與pMD18?T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在37℃下培養(yǎng)12?h，挑取上述白色菌落，接種到含有氨芐青霉素的2×YT液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)過夜至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定；3）將重組質(zhì)粒pMD18?ORF1與pEGFP?C1載體分別進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，回收純化目的片段，將二者用T4?DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行KpnI和XmaI雙酶切，用試劑盒（具體用什么試劑盒？）提取獲得陽性重組質(zhì)粒pEGFP?C1??PCV2??ORF1，并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定；4）真核構(gòu)建體系為：目的DNA片段8μL、pEGFP?C1?2μL、T4?DNA?ligase0.5μL、10×T4?DNA?ligase?buffer?1.5μL、滅菌ddH2O?3.0?μL，總體積15.0?μL；5）培養(yǎng)并收獲處于指數(shù)生長期的PK?15細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用6?mL營養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；然后取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加1?mL上述細(xì)胞懸液和1?mL生長液，放入37℃濃度為5%的CO2?恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?h，使細(xì)胞達(dá)70%~80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Lipofecttamine?TM2000試劑進(jìn)行重組質(zhì)粒pEGFP?C1??PCV2??ORF1轉(zhuǎn)染試驗；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，檢測轉(zhuǎn)染水平；6）將pEGFP?C1??PCV2??ORF1經(jīng)擴增培養(yǎng)后，獲得的pEGFP?C1??PCV2??ORF1質(zhì)粒作為基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗。...
【技術(shù)特征摘要】
1. 一種基于豬圓環(huán)病毒核酸疫苗的制備方法，其特征在于：包括如下步驟 1) 將豬圓環(huán)病毒II型0RF1基因進(jìn)行PCR擴增，豬圓環(huán)病毒II型0RF1基因具有如序 列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，擴增條件為：PCR體系總體積50 y L，其中ddH20 為 37 ii L，10XPCR Buffer 5 ii L，dNTP 1. 0 ii L，上下游引物各 1. 0 ii L，DNA 模板 4. 0 ii L， Taq酶1.0 iiL;擴增程序為：94°C預(yù)變性3min;94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸 1. 5min，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后延伸72°C lOmin ;上游引物的序列為5' -CGGGTACCATGCCC AGCAAGAAGAATG-3，下游引物的序列為 5' -GGCCCGGGTCAGTAAITTAITTCATATGGAA-3，； 2) 將步驟1)中獲得的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量百分比為1%的瓊脂糖凝膠中電泳，切下含目的 條帶的凝膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在37°C下培養(yǎng)12 h，挑取上述白色菌落，接種 到含有氨芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基中，在37°C振蕩培養(yǎng)過夜至混濁，提取質(zhì)粒并進(jìn)行 酶切鑒定； ...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王開功，郭穎初，周碧君，文明，程振濤，
申請(專利權(quán))人：貴州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：貴州;52
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