一種提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。一種大量提取造血前體干細(xì)胞的方法，包含以下步驟：(1)從胎盤中分離單個核細(xì)胞；(2)從單個核細(xì)胞中先分選出CD133+陽性細(xì)胞群，然后再從CD133+陽性細(xì)胞群中分選出其中的CD133+CD34+細(xì)胞群，而流出的細(xì)胞群即為CD133+CD34-的造血前體干細(xì)胞。本發(fā)明專利技術(shù)發(fā)現(xiàn)在胎盤中含有比臍帶血濃度高10倍以上，含量高30倍以上的CD133+CD34-干細(xì)胞群，這種細(xì)胞群不但是造血干/祖細(xì)胞的起始細(xì)胞，具有長期重建造血細(xì)胞的能力，是移植給宿主后可以長期植活的干細(xì)胞，而且還具有較強(qiáng)的可塑性，在再生醫(yī)學(xué)和治療細(xì)胞損傷等疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
-種提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種大量提取造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用， 具體涉及一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在特定條件下可經(jīng)誘導(dǎo)分化為其它種類細(xì) 胞，人們期望將來用該種方法進(jìn)行組織修復(fù)，用于治療帕金森癥、糖尿病、老年性癡呆、也臟 病、脊髓損傷等。我們的專利從胎盤組織中提取造血干細(xì)胞用于建立造血干細(xì)胞庫的方 法，專利號；ZL011311908,國際專利主分類號；C12N5/08中指出胎盤中含有豐富的造血干 細(xì)胞，因此可W代替異體骨髓來恢復(fù)重建患者的骨髓，換言之，即用它來置換骨髓。同時在 我們的另一篇專利中也提出了 一種從剖腹產(chǎn)胎盤組織中提取原始間充質(zhì)和造血干/祖細(xì) 胞方法（專利號：200610098886)。該種方法可W用來收集來自于胎盤組織的單個核細(xì)胞 去建立造血前體干細(xì)胞庫。應(yīng)用該些方法可W收集并長期凍存現(xiàn)在廢棄的新生兒胎盤內(nèi)的 細(xì)胞，胎盤組織內(nèi)的造血干細(xì)胞，建立自體或異體的胎盤造血前體干細(xì)胞儲存庫，提供全國 乃至全世界患者選擇胎盤造血前體干細(xì)胞為細(xì)胞治療應(yīng)用。 [000引 CD34分子一直被認(rèn)為是服C/造血祖細(xì)胞她C)的表面標(biāo)記。血液界到目前為止 都W CD34+的HSC的含量作為移植能否成功的值標(biāo)。1997年有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在哺乳動物體內(nèi) 存在一群CD34-細(xì)胞也有重建造血的功能，表明CD34+是較為成熟的細(xì)胞，而CD34 -細(xì)胞是 更原始的服C。W后又有人提出表達(dá)CD133,不論是CD34陽性或陰性的服C/HPC移植到免 疫缺陷小鼠可W形成異位造血組織。同時發(fā)現(xiàn)CD133巧SC具有更強(qiáng)的促進(jìn)血管形成的作用。 廝血CD133+細(xì)胞群中不僅富含服C (實際上當(dāng)時沒有人認(rèn)識到廝帶血只含有少量的CD34-細(xì)胞，大部分是CD34+細(xì)胞），而且該一群細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖潛能和長期造血重建功能，該 些提示CD133是比CD34更原始更幼稚的干細(xì)胞標(biāo)志。研究證實，處于G。期的CD133+細(xì)胞 較處于Gi期的CD133-細(xì)胞更易大量富集而被激活參與造血，其長期造血功能優(yōu)于CD34+細(xì) 胞群。 自從發(fā)現(xiàn)、純化、標(biāo)記抗CD34單克隆抗體開始，使流式細(xì)胞定量檢測在廝帶和胎 盤血或骨髓中的CD34陽性造血干細(xì)胞成為了可能。CD34抗原存在于各種祖細(xì)胞上，其中包 括多能干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。CD34抗原的分子量為105-120KD，具有一個高度糖基化的 類粘蛋白的結(jié)構(gòu)。在流式細(xì)胞儀檢測中，對全血進(jìn)行溶血來去除紅細(xì)胞，標(biāo)本中直接加入英 光標(biāo)記的CD34抗體進(jìn)行染色，然后用流式機(jī)進(jìn)行分析和計算。人CD34陽性細(xì)胞是造血干 細(xì)胞移植時的關(guān)鍵細(xì)胞，決定著移植成功與否的重要條件。目前，臨床上對是否能夠移植都 WCD34陽性細(xì)胞數(shù)量為唯一重要標(biāo)準(zhǔn)。人CD133抗原為5次跨膜糖蛋白，目前發(fā)現(xiàn)的同源 性抗原有CD133_1和CD133_2。其基因分別定位在人類的4號和2號染色體上。CD133首 先是作為造血干/祖細(xì)胞表面標(biāo)志物而被發(fā)現(xiàn)，并被認(rèn)為是比CD34更早期的表面抗原。利 用取自人類骨髓血經(jīng)增生后的CD133+，帶有該種標(biāo)記的細(xì)胞也稱為血管先驅(qū)細(xì)胞。細(xì)胞直 接注入也肌梗塞的大鼠也臟，有也肌細(xì)胞恢復(fù)的功能。從外周血中也可W分離出CD34+細(xì) 胞，在體外將其誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，植入動物下肢缺血模型中局部形成新生血管。還可能 治療缺血性疾病如也肌梗死、動脈硬化閉塞癥、糖尿病等，該些引起了人們的廣泛興趣。近 來發(fā)現(xiàn)CD133分子是服Cs (造血干細(xì)胞）特異性標(biāo)志。CD133是一個新發(fā)現(xiàn)的造血干細(xì)胞 表面標(biāo)志，在服Cs分化成熟過程中，CD133的含量迅速降低，而CD34抗原開始表達(dá)，當(dāng)向血 液細(xì)胞分化時，CD34抗原表達(dá)開始消失。 上述大量的臨床實踐已證實，來自于骨髓、動員周圍血及廝帶血中含有大量的造 血干/祖細(xì)胞，即CD34+細(xì)胞，該種細(xì)胞能夠重建受損傷的造血組織恢復(fù)造血功能。而該種 CD34+細(xì)胞來自于其更早期的細(xì)胞，即從CD133陽性細(xì)胞分化而來，而正是該種CD133+CD34+ 或CD33+CD34-細(xì)胞群移植給宿主后可W長期植活。廝帶血中僅含有少量CD133+CD34-細(xì)胞， 該也造成廝帶血移植后，部分造血干細(xì)胞不易植活，或需要植活的時間長的重要原因之一。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)首先發(fā)現(xiàn)廝帶血中不含有CD33+CD34-細(xì)胞，而胎盤血和胎盤組織富含該類 細(xì)胞，僅管骨髓也有該類細(xì)胞，但骨髓不能規(guī)模提取。本專利技術(shù)的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述 不足，提供一種從胎盤大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法。 本專利技術(shù)的另一目的是提供胎盤造血前體干細(xì)胞的應(yīng)用。 [000引本專利技術(shù)的目的可通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)： 本專利技術(shù)從胎盤血和胎盤組織中發(fā)現(xiàn)一種新型的干細(xì)胞群，命名為胎盤早期造血前 體干細(xì)胞： (1)該種細(xì)胞群來自于去除廝帶血后殘留在胎盤內(nèi)的血液或是從胎盤組織中經(jīng)過 機(jī)械處理（沖洗、擠壓、碼磨），或酶消化（膜酶、膠原酶、木瓜酶）等獲得的單個核細(xì)胞。 (2)該種細(xì)胞群在流式細(xì)胞儀（FACS)的檢測中為CD133+CD34XDl(n-CD29-CD3r， 幾乎不存在于正常人周圍血和廝帶血中。 [001引 做造血前體干細(xì)胞為一群CD133+CD34-和CD133+CD34+的干細(xì)胞群，而 〔0133+〔034^為早期造血前體干細(xì)胞，該種干細(xì)胞存在于提取的胎盤干細(xì)胞內(nèi)，它可^通過 胎盤分離濃縮后于液氮內(nèi)長期保存。 (4)該種細(xì)胞群在干細(xì)胞集落培養(yǎng)試驗中，其形成集落細(xì)胞（即每個細(xì)胞能擴(kuò)增 成50個細(xì)胞W上）遠(yuǎn)較CD133-CD34+細(xì)胞為晚，在培養(yǎng)后的24小時，后者即可形成大量 成堆的細(xì)胞群的集落，而早期造血前體干細(xì)胞細(xì)胞需96小時W上。CD133-CD34+細(xì)胞能 生成早期集落，但不易長期生長，而是CD33+細(xì)胞可W長期穩(wěn)定生長，移植標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該W程度 CD133+的含量多少來預(yù)測移植物的植活效果 (5)該種細(xì)胞群可W和干細(xì)胞生長因子佑-CSF、GM-CSF、SCF等）或血管內(nèi)皮生長 因子（VEG巧等共同培養(yǎng)，該細(xì)胞群可貼壁生長，具有明顯的遷移性，形成單層細(xì)胞，具有向 內(nèi)皮細(xì)胞分化的功能，即該類細(xì)胞可分化為CD133+的血管內(nèi)皮干/祖細(xì)胞。 (6)該類細(xì)胞在有干細(xì)胞刺激因子佑-CSF，EP0)的培養(yǎng)液中，具有大量增殖的功 能，可W擴(kuò)增到1000倍W上，其擴(kuò)增后的終未細(xì)胞主要為紅細(xì)胞系，巧PO的刺激下），但如 果和白細(xì)胞刺激因子共同培養(yǎng)，也可擴(kuò)增為大量的白細(xì)胞。 (7)該類細(xì)胞具有更大的可塑性，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，當(dāng)該類細(xì)胞貼壁生長W后， 加入組織細(xì)胞相應(yīng)的刺激因子，具有向肝臟細(xì)胞，骨細(xì)胞，也臟細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞等形成的能 力。 (8)在移植免疫免疫缺陷病小鼠動物模型中，W同等劑量，用來自胎盤的早期造血 前體干細(xì)胞CD133+CD34-細(xì)胞群和CD133+CD34+細(xì)胞群注射給干細(xì)胞移植小鼠動物，早期造 血干細(xì)胞具有長期植活效能。 (9)早期造血前體干細(xì)胞的標(biāo)志為CD133+CD34-，而CD133分子量為120邸a,具有5 個跨膜區(qū)，它在體外培養(yǎng)中，可W形成各種本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法，其特征為：所述的早期造血前體干細(xì)胞為一群CD133+CD34?的細(xì)胞群，來源于去除臍帶血后殘留在胎盤內(nèi)的血液或是從胎盤組織經(jīng)過機(jī)械處理或酶消化獲得的單個核細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀的檢測中為CD133+CD34?CD105?CD29?CD31?，幾乎不存在于正常人周圍血和臍帶血中。

【技術(shù)特征摘要】
1. 一種從人體健康胎盤中大量提取早期造血前體干細(xì)胞的方法，其特征為：所述的早 期造血前體干細(xì)胞為一群⑶133+⑶的細(xì)胞群，來源于去除臍帶血后殘留在胎盤內(nèi)的血 液或是從胎盤組織經(jīng)過機(jī)械處理或酶消化獲得的單個核細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀的檢測中為 ⑶133+CD34TD105TD29XD3r，幾乎不存在于正常人周圍血和臍帶血中。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 從胎盤血或胎盤組織中分離單個核細(xì)胞； (2) 從單個核細(xì)胞中先分選出CD133+陽性細(xì)胞群，然后再從CD133+陽性細(xì)胞群中分選 出其中的⑶133+⑶34+細(xì)胞群，而流出的細(xì)胞群即為⑶133+CD34_的造血前體干細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的從胎盤中分離的單個核細(xì)胞進(jìn)行濃 縮后再進(jìn)行分選。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟（2)通過從濃縮后的胎盤單個核細(xì)胞 中采用MACS磁珠分選出CD133+CD341 勺早期造血前體干細(xì)胞，或者從濃縮后的胎盤單個核 細(xì)胞中采用任何抗CD34或抗CD133的抗體和生物反應(yīng)素結(jié)合，或者和第二抗體結(jié)合去分選 ⑶133+CD3C的早期造血前體干細(xì)胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于采用MACS磁珠分選的方法，用抗CD133磁 珠單克隆抗體從單個核細(xì)胞中先分選出CD133+陽性細(xì)胞群，然后再從CD133+陽性細(xì)胞群 中應(yīng)用抗CD34磁珠單克隆抗體分選出其中的CD133+CD34+細(xì)胞群，而流出的細(xì)胞群即為 ⑶133+CD3C的早期造血前體干細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的從胎盤血或胎盤組織中分離單個核 細(xì)胞的方法為： (1) 收集胎盤，向臍帶靜脈內(nèi)注入含有25?50毫升抗凝劑和抗生素的生理等滲溶液或 緩沖液；采用臍帶動、靜脈灌洗法收集胎盤血；其中，所述的抗生素選自青霉素、鏈霉素或 制霉囷素； (2) 采用有機(jī)溶劑及生理緩沖液清除胎盤組織和臍帶外表的透明質(zhì)粘液，采用機(jī)械擠 壓及酶和生理緩沖液沖洗的方法，沖洗掉任何殘留的血液； (3) 離心收集胎盤組織干細(xì)胞：...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周勝利，鄭超，
申請(專利權(quán))人：賽歐帕克江蘇干細(xì)胞生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32