生物液體中的稀有細胞的檢測、分離和分析制造技術

本發明專利技術提供了一種利用與稀有細胞的細胞表面抗原結合的抗體從哺乳動物的生物液體中分離或富集稀有細胞的方法。將固定化抗體與包含稀有細胞以及多種其他細胞的生物液體一起溫育，以便形成抗體-稀有細胞復合體。可通過各種物理、化學和基因技術的任意一種對該復合體進行檢測或分離并隨后進行分析。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】生物液體中的稀有細胞的檢測、分離和分析
本專利技術涉及用于從生物液體中檢測、捕獲和分離稀有細胞以對其抗原性、表型和 遺傳特性進行分析的免疫學方法和試劑盒。具體而言，本專利技術提供了用于對母體血液中的 胎兒單核紅細胞（NRBC)進行檢測、捕獲、分離和分析的方法。
技術介紹
進行產前診斷以檢測胎兒的可能存在的染色體和基因異常使得父母和看護者能 夠開始監控疾病或病癥的傾向早期治療。已經建立了產前診斷的實踐，以檢測胎兒可能存 在的染色體和基因異常，因而使父母和照顧者能夠作出知情決定。在多種與生命相容的染 色體異常中（非整倍體21、18、13、X、Y) (1)，由于存在全部或部分的21號染色體多余拷貝 所導致的唐氏綜合癥（DS)，是最常見的引起智力遲緩的遺傳原因以及婦女尋求產前診斷的 主要原因（1，2)。盡管通過對由絨毛膜絨毛取樣（3)、羊水穿刺（3,4)或臍帶取樣（5)獲得 的胎兒組織進行核型分析從而確切檢測到染色體異常和單基因病是可能的，但是這些方法 是高度侵入性的，需要有技術的專業人員，并且有高風險的流產（高至1% )和/或孕婦并 發癥（3-5)的傾向。約1%的活胎出生、2%的35周歲以上孕婦以及約50%的自發性妊娠 早期流產中會出現細胞基因紊亂￠)。在一百萬個活胎出生的人群中，單基因缺陷的發生率 約為 0· 36% (7)。 為了最小化例如DS等疾病中的風險，將這些侵入性但是確切的的檢測提供給通 過一系列篩查標準而被鑒定為具有胎兒染色體異常最高風險的婦女。該組通常包括生產年 齡在35歲以上并且在妊娠一期和二期所進行的胎兒超聲檢查和母體血清標記物篩查測試 中出現異常應答的孕婦（8)。優選的妊娠一期的篩查，包括對血清中的PAPP-A (妊娠相關血 漿蛋白A)、游離β-hCG(游離β -人絨毛膜促性腺激素）進行定量，以及頸項透明層的超 聲檢查，具有約90%的DS檢出率，但是代價是具有顯著意義的5%假陽性率（8)。對一期 篩查研究進行的最近匯總分析得出結論，在實踐中所能達到的靈敏度可能會顯著低于（約 80-84%)所報道的靈敏度。這種表現不佳的問題，特別是考慮到5%的篩查陽性率，總是 會導致高比率的不必要且昂貴的侵入性驗證測試，并因此增加妊娠發展的風險。 明顯的局限性是用于尋找替代策略的主要的社會、科學和經濟動機。后者由 于DS發生率的上升而被強化，主要是由于懷孕時母體年齡增加的趨勢，而出生率并沒有 相對等的增加（10)。美國婦產科醫師學會（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)近期提出了指導原則，建議其成員對所有預期中的母親進行基因異 常的檢測（11)，這進一步暗示了對于可安全地對胎兒基因狀況進行特異性診斷的非侵入性 技術的需求未得到滿足。因此，非侵入性產前診斷的開發已經成為現代醫學中最具進取性 爭議的領域之一（12)。預期候選策略會包含現有侵入性方法的所有優點，以使得能將它們 能夠作為單獨運行的非侵入性診斷測試或被用作高精度的驗證測試以對當前篩查實踐中 的大量假陽性進行分析（13)。此外，這種新的測試策略應當另外解決了分析、制造和操作中 的復雜性，使得該新的方法提供了可靠、簡便和經濟有效的替代性方案。 幾十年來，對于非侵入性替代方案的探索集中在對正常情況下可穿過胎盤屏障進 入母體循環系統中的胎兒基因材料的分離、鑒定以及隨后的分析之上。自從1893年關于 胎兒細胞檢測的首創性報道（14)以及稍晚一些的關于母體血液中胎兒無細胞DNA(15)和 RNA(16)檢測的報道以來，有兩種基于對胎兒細胞或無細胞胎兒基因材料進行分析的有前 途的方法受到了極大的關注。與無細胞的胎兒DNA或RNA相比，完整的胎兒細胞可以提供 獲取對于檢測染色體異常來說重要的完整胎兒基因材料以及對胎兒基因狀況進行更全面 評估（17)。由于在伴隨有染色體異常的母體中或在諸如先兆子癇等的疾病中胎兒細胞數目 相對增加（18)，可靠的分離方法可能會基于胎兒細胞計數和/或細胞檢測信號定量而使其 適合于新型非侵入性診斷方法的開發。 很多顯著的挑戰會阻礙開發可靠的胎兒細胞分離方法。據報道的每毫升母體血液 大概一至兩個細胞的罕見事件發生率對于可再現分離具有足夠純度和產量的胎兒細胞而 言，已經被認為是難以逾越的障礙（18)。因此，一種成功的細胞分離策略會需要優異的效 率、靈敏度和特異性。由于迄今為止已經通過易于導致低產率和細胞損失的低效多步驟技 術獲得了所報道的數目，進入母體血液循環的胎兒細胞的數量可能要顯著高于原先人們所 相信的那樣。在各種候選胎兒細胞（19)(滋養層細胞、淋巴細胞、有核紅細胞以及造血干 細胞）中，有核紅細胞（NRBC)，也被稱為成紅細胞（erythroblasts)，具有大部分所需要的 特征。胎兒NRBC具有有限的壽命和增殖能力，是單核的，攜帶胎兒染色體的代表性補充物 (complement),并始終存在于母體血液之中（17-20)。然而,對于胎兒成紅細胞生成的研究 已經鑒定出了兩個不同的過程，開始發生于卵黃囊中（原始成紅細胞生成，產生原始成紅 細胞）以及隨后發生于胎兒肝臟和骨髓中（產生定型成紅細胞）（17)。原始和定型成紅細 胞兩者在母體循環系統中都已經被檢測到，但是它們出現的確切時間、其相對數目以及在 整個孕期的分布情況還沒有被清楚地定義。然而，雖然原始成紅細胞是妊娠一期占據優勢 地位的細胞類型，但它們會逐漸被能夠持續至整個期間的定型類所代替（17,20)。 原始成紅細胞具有不同的形態學特征，即胞質與細胞核的比例高，尺寸相對較大， 并且含有被稱為ε-球蛋白的胚胎型血球蛋白（17,20)。綜合以上，上述的特征和各種細 胞表面標記物（如分化簇標記物（⑶34、⑶35、⑶36、⑶45、⑶47、⑶71)，血型糖蛋白-A和 i_抗原）差異表達的知識（17, 20, 21)已經將原始成紅細胞確定為理想的妊娠一期靶標。 胎兒血液中的ε -陽性成紅細胞從第7周開始線性地降低，在妊娠約14周時 數量可忽略不計（22)。另一方面，近期的報道表明定型成紅細胞在進入血液循環之前去 核（17)，如果該報道被證實，則妊娠一期原始成紅細胞將依然是唯一有用的靶標。據報道 ε -球蛋白是高度特異性的原始胎兒成紅細胞鑒定標識（20, 22)。 當前對于非侵入性產前診斷的方法是基于利用靶細胞的物理、結構、形態和抗原 性屬性，到目前為止已利用了三個獨立步驟的步驟（22,23)。這些步驟是（1)，為了從母體 血液中富集胎兒細胞而設計的技術的開發；（2)，從所富集細胞的異源混合物中鑒定出胎兒 細胞；以及（3)，在對靶標進行顯微操作之前和/或之后通過染色體熒光原位雜交（FISH)、 各種PCR技術和/或基因測序來對所鑒定的細胞進行基因分析（17,21-23)。為了使目前這 種復雜性、低效性和不一致性最小化，也已經考慮到了將胎兒細胞的鑒定步驟與基于分子 遺傳學的診斷組合的方法（22)。 近期的綜述認為，目前胎兒細胞分離策略的不足之處是限制可靠的非侵入性產前 診斷方法開發的主要因素（18)。目前，研究最多的胎兒細胞富集方法包括選擇性紅細胞裂 解、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
從哺乳動物的生物液體中分離或富集稀有細胞的方法，所述方法包括：(i)提供固定在基質上的抗體，所述基質例如大平板、陪替氏培養皿、孔、微孔、載玻片、條、桿、珠或微陣列板或微陣列載玻片，其中所述抗體結合所述稀有細胞的細胞表面抗原；(ii)使固定化的抗體與生物液體樣品接觸，其中體液包含所述稀有細胞和多種其他細胞；(iii)將固定化的抗體與體液樣品在適合于所述抗體與所述稀有細胞的細胞表面抗原結合的條件下溫育，以形成抗體?稀有細胞復合體；以及(iv)洗滌所述抗體?稀有細胞復合體，以除去未結合的細胞并提供固定化的抗體?稀有細胞復合體。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.11.14 US 13/295,5321. 從哺乳動物的生物液體中分離或富集稀有細胞的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基質上的抗體，所述基質例如大平板、陪替氏培養皿、孔、微孔、載玻片、 條、桿、珠或微陣列板或微陣列載玻片，其中所述抗體結合所述稀有細胞的細胞表面抗原； (ii) 使固定化的抗體與生物液體樣品接觸，其中體液包含所述稀有細胞和多種其他細 胞； (iii) 將固定化的抗體與體液樣品在適合于所述抗體與所述稀有細胞的細胞表面抗原 結合的條件下溫育，以形成抗體-稀有細胞復合體；以及 (iv) 洗滌所述抗體-稀有細胞復合體，以除去未結合的細胞并提供固定化的抗體-稀 有細胞復合體。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述抗體對胎兒細胞表面抗原是特異性的。3. 如權利要求2所述的方法，其中所述胎兒細胞表面抗原是胎兒有核紅細胞抗原。4. 如權利要求3所述的方法，其中所述抗體是抗體4B9。5. 如權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是人。6. 如權利要求1所述的方法，其中所述生物液體是血液、血漿、羊水、尿液或來自絨毛 膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細胞懸浮液。7. 對生物液體中的稀有細胞進行檢測的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基質上的第一抗體，其中所述第一抗體結合所述稀有細胞的第一細胞 表面抗原； (ii) 使固定化的第一抗體與生物液體樣品接觸，其中體液包含所述稀有細胞和多種其 他細胞； (iii) 將固定化的第一抗體與體液樣品在適合于所述第一抗體與所述稀有細胞的第一 細胞表面抗原結合的條件下溫育，以形成第一抗體-稀有細胞復合體； (iv) 洗滌所述第一抗體-稀有細胞復合體，以除去未結合的細胞并提供分離的第一抗 體-稀有細胞復合體； (V)將所述第一抗體-稀有細胞復合體與結合所述稀有細胞的第二細胞表面抗原的第 二抗體在適合于所述第二抗體與所述第二細胞表面抗原結合的條件下溫育，以形成第一抗 體-稀有細胞-第二抗體復合體；以及 (Vi)檢測所述第一抗體-稀有細胞-第二抗體復合體中的所述第二抗體，從而檢測所 述體液樣品中所述稀有細胞的存在。8. 如權利要求7所述的方法，其中所述生物液體是血液、血漿、羊水、尿液或來自絨毛 膜絨毛取樣（CVS)活組織檢查的細胞懸浮液。9. 如權利要求7所述的方法，其中所述第一抗體對胎兒細胞表面抗原是特異性的。10. 如權利要求9所述的方法，其中所述第一抗體是抗體4B9。11. 如權利要求9所述的方法，其中所述第二抗體對胎兒細胞表面抗原是特異性的。12. 如權利要求11所述的方法，其中所述第二抗體對胎兒e-球蛋白、⑶36、⑶71或 ⑶47是特異性的。13. 如權利要求7所述的方法，其中所述第一抗體對⑶36、⑶71或⑶47是特異性的。14. 如權利要求7所述的方法，其中所述第二抗體是抗體4B9。15. 如權利要求7所述的方法，其中通過將所述第一抗體-稀有細胞...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J·科霍斯羅維，L·H·凱爾納，H·班娜妮，
申請(專利權)人：科勒本斯公司，
類型：發明
國別省市：美國;US