本發明專利技術公開了一株水解米渣的蛋白酶產生菌：枯草芽孢桿菌及其篩選和使用方法，該枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）菌株純培養物于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢·武漢大學，郵編430072，簡稱枯草芽孢桿菌HP90，保藏編號CCTCCNO.M2014201。通過初篩和復篩篩選得到目標菌株。取斜面保藏菌株培養后，即直接用于米渣中蛋白質的水解。枯草芽孢桿菌HP90用于米渣蛋白水解，水解度達19.83％。該菌株成本低、能循環利用、穩定性好、綠色安全、能直接用于生物催化，原料來源廣泛，方法簡單實用，因此，該菌株具有重要應用前景，還可應用于其他蛋白質的水解。
【技術實現步驟摘要】
-株水解米渣的蛋白酶產生菌：枯草芽抱桿菌及其篩選與 使用方法
本專利技術涉及微生物或酶，特別涉及蛋白酶產生菌。
技術介紹
稻谷，在植物學上屬禾本科稻屬普通栽培稻亞屬種的普通稻亞種，是全球第一大 糧食品種。稻谷的年均產量大約占到了全國糧食總產量的2/5,達到了 1.90億t。米渣是 W早釉米、碎米、陳化米等為原料進行發酵和生產糖漿、味精、生化藥品等過程中被過濾掉 米漿后剩下的殘渣，價格低廉，產量巨大，在大米淀粉糖的生產過程中每消耗7t大米就要 產生It米渣。米渣中蛋白質含量約為40%?70%，相當于稻谷中蛋白質含量的5?8倍， 其含量接近大豆，而且氨基酸配比符合WH0/FA0推薦的理想模式，其品質被公認為糧食種 子蛋白中的最佳者。但是該些優質的蛋白質資源大部分都W干粉的形式廉價的賣給了飼料 廠做飼料，并沒有得到深度開發和利用，若將該些米渣蛋白資源轉化成具有高附加值的氨 基酸和多膚，不但能提高其生物效價、經濟價值，對提高我國稻谷深加工的技術含量，W及 促進整個糧食產業的發展都有著深遠的影響。 蛋白質經酸、堿或者蛋白酶處理可獲得氨基酸和多膚。酸、堿水解作用強烈會破壞 一些敏感氨基酸，并且生成有毒的氯丙醇類物質。酶水解條件溫和，對敏感氨基酸無破壞， 能最大保留原料理化性質、風味、功能特性、綠色安全，能耗小。可是目前多數利用商品蛋白 酶水解蛋白質，該使得工業化生產成本較高，因此，篩選蛋白酶產生菌尤為重要。 目前中國專利數據庫中，涉及蛋白酶產生菌的專利申請件不多，僅有 ZL2010101038046號《一種耐有機溶劑蛋白酶產生菌及其所產耐有機溶劑蛋白酶的基因和 應用》、2007101919691號《一種耐有機溶劑堿性蛋白酶產生菌W及該耐有機溶劑堿性蛋白 酶的基因和應用》和2013101991045號《一種膠原蛋白酶產生菌》。至今為止，尚無涉及水 解米渣的蛋白酶產生菌的申請件。
技術實現思路
本專利技術旨在提供一株水解米渣的蛋白酶產生菌一枯草芽抱桿菌，使之能夠用于 米渣蛋白的生物法水解。 本專利技術的又一目的是提供上述枯草芽抱桿菌的篩選方法及使用方法，使其具備特 定的工業用途。 為達到上述目的，專利技術人提供一株水解米渣的蛋白酶產生菌是枯草芽抱桿菌 炬acillus subtilis)，該菌株純培養物已經于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培 養物保藏中也，保藏單位地址：中國武漢?武漢大學，郵編430072,保藏編號為CCTCC NO. M 2014201。該菌株簡稱枯草芽抱桿菌HP90,系從中國貴州傳統臘腸中分離得到。 上述枯草芽抱桿菌HP90形態特征和生理生化特征接近芽抱桿菌屬，枯草芽抱桿 菌HP90 的 16S rRNA序列與公細(AJ276351)序列同源性在99% W上，看家基因recA序列與公acj77s s如/7. (CP002906. I) 序列同源性達99%。根據《伯杰氏系統細菌學手冊>中芽抱桿菌屬的分類概況，HP90屬 芽抱桿菌綱MaciWi )，芽抱桿菌目MacW知7es )，芽抱桿菌科)，芽抱桿菌 屬(公aciJ7化0,枯草芽抱桿菌種(化?ciJ7化況 專利技術人提供的枯草芽抱桿菌HP90菌株的篩選方法是；先從臘腸采樣，將樣品中的 蛋白酶產生菌分別經富集培養后，采用酪蛋白為底物，經過富集培養后稀釋涂布在酪蛋白 平板選擇培養基上，W微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標，挑取具有透明圈較大的菌 落在酪蛋白平板上H區劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養基保存，從而實現初篩；之 后W米渣為底物，搖瓶發酵復篩，W微生物搖瓶發酵米渣，離也，上清液注酪蛋白平板孔，恒 溫培養，W平板孔直徑為指標第一次復篩；平板經直徑較大的菌株再經搖瓶發酵米渣，離也 后測上清液蛋白酶活力，W酶活為指標二次復篩；最后酶活較高的菌株發酵米渣，離也，上 清液沸水滅酶，測上清液中氨態氮，W氨態氮為指標第H次復篩。 所述富集培養的條件為：富集培養基W g/lOOmL計的成分；牛肉膏0. 5?1. 0,蛋 白腺 0. 5 ?1. 0,（畑4)25〇4 0. 1 ?0. 2，K2HP04 0. 5 ?1. 0，M拆〇4 0. Ol ?0. 02，CaCl2 0. Ol?0. 02,化Cl 0. 5?1. 0，pH 6. 5?7. 5 ;酪蛋白選擇培養基W g/100血計的成分：牛 肉膏 0. 5 ?1. 0,酪蛋白 0. 5 ?1. 0，（畑4)25〇4 0. 1 ?0. 2,馬冊〇4 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02,化Cl 0. 5 ?1. 0,瓊脂粉 2. 0,抑 6. 5 ?7. 5 ;斜面保藏 培養基細菌為細菌完全培養基，真菌為PDA培養基；種子培養基同發酵培養基W g/1 OOmL計 的成分：米渣 1. 2 ?1. 8,化Cl 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02， 馬冊〇4 0. 5 ?1. 0, pH 6. 5 ?7. 5。 為了驗證本專利技術的菌株，進行了如下實驗： (1)樣品采集： 23個分離樣品分別采集于2012年10月，從貴州花溪傳統臘肉、豆鼓、酸肉、發酵肉、豆 制品、酒曲、酒酷等采樣，用聚己帰袋封口；2012年11月從貴州矜東南屠宰場及花溪貴州大 學南區食堂附近的表層±壤、齡泥采樣，用聚己帰袋封口；取回樣品后，即著手分離工作。 [00 1引 口)富集培養： 稱取5. Og樣品，加入到50血無菌生理鹽水中，再放入4顆小玻璃珠，于30°C、18化/min 下振蕩培養30min，取5mL加入富集培養基中，3(TC、180r/min下搖床富集培養2化； 上述富集培養基的成分為（W g/100血計）；牛肉膏0.5?1.0,蛋白腺0.5?1.0， (NH4)2S04 0. 1 ?0. 2,馬冊04 0. 5 ?1. 0, MgS04 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol ?0. 02， 化Cl 0. 5?1. 0 ;培養基的抑6. 5?7. 5。 (3)初篩： 取上述0. 2mL稀釋適當梯度的富集菌液涂布于酪蛋白選擇培養基平板，靜置5min，倒 置平板，于3(TC培養。挑取形成透明圈較大的單一菌落，劃線純化后在試管斜面上劃Z形 線，3(TC條件下培養至出現豐滿的菌落后，4 C冰箱保藏。 初篩共獲得形成明顯透明圈的菌株115株，其中菌株HP90形成的透明圈最大。 [00巧]上述初篩酪蛋白選擇培養基的成分為（W g/100血計）；牛肉膏0.5?1.0,酪蛋 白 0. 5 ?1. 0，（畑4)25〇4 0. 1 ?0. 2,馬冊〇4 0. 5 ?1. 0, M拆〇4 ? 7&0 0. Ol ?0. 02, CaCla 0. Ol?0. 02,化Cl 0. 5?1. 0,瓊脂粉2. 0 ;培養基的抑6. 5?7. 5。 斜面保藏培養基；細菌用細菌完全培養基，真菌用PDA培養基。 (4)第一次復篩： 用打孔器在初篩酪蛋白選擇培養基平板上打孔，每本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株水解米渣的蛋白酶產生菌：枯草芽孢桿菌，其特征在于該枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）菌株純培養物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址：中國武漢·武漢大學，郵編430072，簡稱枯草芽孢桿菌HP90，保藏編號為CCTCC?NO.?M?2014201。
【技術特征摘要】
1. 一株水解米渣的蛋白酶產生菌：枯草芽孢桿菌，其特征在于該枯草芽孢桿菌 菌株純培養物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保 藏中心，保藏單位地址：中國武漢?武漢大學，郵編430072,簡稱枯草芽孢桿菌HP90,保藏編 號為 CCTCC NO. M 2014201。2. 如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌HP90的16S rRNA序列與似57序列同源性在99%以上，看家基因recA序 列與5^5/7. 7?0tW-7序列同源性達99 %;根據《伯杰氏 系統細菌學手冊》中芽孢桿菌屬的分類規定，HP90屬芽孢桿菌綱(feciBi)，芽孢桿菌 目（ifeciJJa/es )，芽孢桿菌科(ifeci77acea<9 )，芽孢桿菌屬)，枯草芽孢桿菌種 {Bacillus subtil is、。3. 如權利要求1和2所述的解淀粉芽孢桿菌的篩選方法，其特征在于：先從臘腸采樣， 將樣品中的蛋白酶產生菌分別經富集培養后，采用酪蛋白為底物，經過富集培養后稀釋涂 布在酪蛋白平板選擇培養基上，以微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標，挑取具有透明 圈最大的菌落在酪蛋白平板上三區劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養基保存，從而 實現初篩；之后以米渣為底物，搖瓶發酵復篩，以微生物搖瓶發酵米渣，離心，上清液注酪蛋 白平板孔，恒溫培養，以平板孔直徑為指標第一次復篩；平板經直徑最大的菌株再經搖瓶發 酵米渣，離心后測上清液蛋白酶活力，以酶活為指標二次復篩；最后酶活較高的菌株發酵米 渣，離心，上清液沸水滅酶，測上清液中氨態氮，以氨態氮為指標第三次復篩。4. 如權利要求3所述的篩選方法，其特征在于：富集培養基以g/100mL計的成分：牛 肉膏 0? 5 ?1. 0,蛋白胨 0? 5 ?1....
【專利技術屬性】
技術研發人員：何臘平，薛榮濤，李翠芹，
申請(專利權)人：貴州大學，
類型：發明
國別省市：貴州;52
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