使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶鏈式反應檢測系統技術方案

本發明專利技術涉及用于在試驗系統中檢測核酸的方法和試劑盒。在一個方面，本發明專利技術涉及在存在缺少3’-5’核酸酶活性的聚合酶時減少引物延伸反應中非特異性擴增和引物二聚體形成的方法。在另一個方面，本發明專利技術涉及檢測在存在缺少3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶時產生的引物延伸產物的方法，包括提供能夠彼此雜交以形成熒光淬滅對的具有不同Tm的第一和第二單標記的寡核苷酸。在本發明專利技術的方法中，一條或更多條引物或寡核苷酸含有至少一個硫代磷酸酯基。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種在試驗系統中用于檢測核酸的方法和試劑盒。
技術介紹
聚合酶鏈式反應(PCR)是一種快速且指數式擴增目標核酸序列的有力方法。PCR促進了基因表征和分子克隆技術的發展，包括PCR擴增的DNA的直接測序、等位基因變異的測定以及傳染性和遺傳性疾病病癥的檢測。通過下述重復循環進行PCR：將含有目標序列的DNA模板熱變性、將反向引物與互補DNA鏈退火和使用DNA聚合酶將退火的引物延伸。多重PCR循環導致由側翼擴增引物圈定的核苷酸序列指數式擴增。在PCR方案中加入熱穩定的DNA聚合酶避免了重復添加酶的需要并使退火和引物延伸的溫度提高，該溫度提高了引物：模板相關的特異性。因此，Taq?DNA聚合酶可用于增加PCR的特異性和簡便性。在許多基于PCR的反應中，采用信號生成系統，如用于檢測擴增產物的產生。在基于PCR的反應中所使用的信號生成系統之一是熒光能量轉移(FRET)系統，其中核酸檢測物(detector)包括熒光供體和受體基團。FRET標記系統具有許多優于其它標記系統的優勢，包括進行勻相試驗的能力，其中并不需要結合的與未結合的標記的核酸檢測器的分離步驟。許多現有技術的主要問題與雙標記的熒光寡核苷酸的合成相關。歐洲專利申請EP1726664公開了一種解決這一問題的檢測系統，其使用具有不同解鏈溫度(Tm)的單標記的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列在理想溶液(free?solution)中彼此雜交以形成熒光猝滅對，其通過將互補序列引入到一個或兩個序列上來生成可測量的信號，序列之一具有低于PCR過程的退火溫度(Ta)的Tm。在使用標記的核酸檢測物的檢測系統中，高保真擴增是非常關鍵的。由于PCR過程和Taq?DNA聚合酶的性質，此類方法可能遇到所需要聚合反應之外的其它副反應。例如，當在環境溫度下進行反應時，PCR可能遇到非特異性擴增。在亞PCR溫度下，Taq聚合酶保留部分活性，因此可以延伸非互補退火的引物，從而導致形成非預期產物。然后新合成的區域將作為進一步引物延伸和非預期擴增產物合成的模板。然而，如果在聚合起始之前將反應加熱至約50℃或更高的溫度，這將增加引物退火的嚴謹性并避免或降低非預期PCR產物的合成。引物二聚體也是一種常見的影響PCR的副反應。發生引物二聚體的積聚是因為引物相互之間的雜交和延伸。形成引物二聚體導致試劑損耗并因此整體降低PCR效率。熱啟動PCR是減少非特異性擴增的一種方法，并因此限制了引物二聚體的形成，且已開發了多種不同的方法來實現這一目的，參見例如Moretti,T.等人，Enhancement?of?PCR?amplification?yield?and?specificity?using?AmpliTaq?Gold?DNA?polymerase.BioTechniques?25,716–22(1998)和Hot?Start?PCR?with?heat-activatable?primers:a?novel?approach?for?improved?PCR?performance?Nucleic?Acids?Res(2008)36(20):e131。然而，此類技術僅部分緩解了此類問題。由于序列中的任何錯誤、并非基于聚合的反應或引物錯配(如引物二聚化)都可能導致產生弱信號或錯誤信號，尤其是在等位基因特異性PCR中，因此期望進一步改善這些弱的或不正確的信號。硫代磷酸酯(或S-oligos)是正常DNA的變體，其中非橋鍵氧原子中的一個被硫取代。磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸間鍵的實例如下所示：在寡核苷酸的磷酸酯骨架上，硫代磷酸酯鍵用硫原子取代了非橋鍵氧原子，使得核苷酸間鍵抵抗核酸酶的降解。可以將硫代磷酸酯引入到寡核苷酸的5'-或3'-末端以抑制核酸外切酶的降解。在反義寡核苷酸中，還將硫代磷酸酯引入到內部以限制核酸內切酶的攻擊。含有硫代磷酸酯的寡核苷酸的合成描述于如Verma?S.和Eckstein,F.(1998).MODIFIED?OLIGONUCLEOTIDES:Synthesis?and?Strategy?for?Users.Annu.Rev.Biochem.1998.67:99-134以及Curr?Protoc?Nucleic?Acid?Chem.2009Mar；第4章：4.34單元.DNA?oligonucleotides?containing?stereodefined?phosphorothioate?linkages?in?selected?positions.Nawrot?B,Rebowska?B。如上所述，核苷酸間鍵的硫化降低了包括5'→3'和3'→5'DNA?POL?1核酸外切酶、核酸酶S1和P1、核糖核酸酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶的內切和外切核酸酶2的作用。已證明了與使用外切核酸酶+DNA聚合酶的高保真PCR組合的S-oligo的核酸酶耐受屬性，參見如Nucl.Acids?Res.(2003)31(3):e7.doi:10.1093/nar/gng007。Taq?DNA聚合酶不具有3'→5'核酸外切酶(Kenneth?R.Tindall,Thomas?A.Kunkel,Biochemistry,1988,27(16),p6008-6013)。也報道了在存在校正(proof-reading)聚合酶的情況下，通過硫代磷酸酯修飾增強單核苷酸多態性的區別。硫代磷酸酯化增加了特異性，減少了引物二聚體相互作用的發生率，但據報道，需要3'核酸酶功能來改善PCR，且已證明，在與等位基因特異性PCR組合時，當與Taq?DNA聚合酶組合時，使用S-oligos未提供益處，參見如Zhang,J.和Li,K.(2003)Single-Base?Discrimination?Mediated?by?Proofreading?3'Phosphorothioate-Modified?Primers.Molecular?Biotechnology?25,223-227。需要在引物延伸產物的檢測中(如在均質PCR試驗中)使用的易于合成的、低成本的和可靠的特異性檢測系統，其解決了現有PCR檢測系統所遇到的問題。與傳統的科學知識相反，本專利技術是基于下述發現：S-oligos可成功地用于核酸檢測試驗系統并使其獲得改善。
技術實現思路
本專利技術提供了一種在模板依賴的引物延伸反應中減少非特異性擴增和/或引物二聚體形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下進行引物延伸反應，其中一個或多個引物包含本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種減少模板依賴的引物延伸反應中的非特異性擴增和/或引物二聚體形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下進行引物延伸反應，其中一個或多個引物包含至少一個硫代磷酸酯基團。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】1.一種減少模板依賴的引物延伸反應中的非特異性擴增和/或引物二聚體
形成的方法，其包括在缺少3'→5'核酸酶活性的聚合酶存在下進行引物延伸
反應，其中一個或多個引物包含至少一個硫代磷酸酯基團。
2.一種檢測在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下產生的引物延伸產
物的方法，所述方法包括以下步驟：
a)提供至少兩個在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對并通過引入互
補于一個或兩個序列的互補序列而產生可測量信號的單標記的寡核苷酸序
列，其中寡核苷酸序列中的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團；
b)提供至少一個引物并起始引物延伸反應，從而產生互補于單標記的寡
核苷酸序列中的至少一個的序列；和
c)測量所產生的可檢測信號。
3.一種檢測在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下產生的引物延伸產
物的試劑盒，其包含至少兩個在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對并通
過引入互補于一個或兩個序列的互補序列而產生可測量信號的單標記的寡核
苷酸序列，其中寡核苷酸序列中的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團。
4.如權利要求2或3所述的方法或試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸序
列具有不同的Tm。
5.如權利要求4所述的方法或試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸序列之
一具有等于或低于引物延伸反應的Ta的Tm。
6.如權利要求4或5所述的方法或試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸序
列之一具有高于引物延伸反應的Ta的Tm。
7.一種檢測在缺少3'→5'外切酶活性的聚合酶存在下通過使用PCR產生
的引物延伸產物的方法，所述方法包括以下步驟：
a)提供第一單標記的寡核苷酸序列和至少一種第二單標記的寡核苷酸序
列和至少一種引物，第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm，其中第一和
第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對，第一和第二寡
核苷酸序列之一具有等于或低于PCR過程的Ta的Tm，其中寡核苷酸序列
的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團，所述至少一種引物包含至少一個

\t未標記的加尾的引物，未標記的加尾的引物具有尾部區域，該尾部區域包含
互補于第二單標記的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列，第一單
標記的寡核苷酸序列是PCR過程中一旦產生互補于第一單標記的寡核苷酸
序列的序列就可由其起始DNA合成的引物，因此第二單標記的寡核苷酸序
列不再能夠與第一單標記的寡核苷酸序列雜交，從而產生可測量的信號；
b...

【專利技術屬性】
技術研發人員：菲利普·史蒂文·魯賓遜，約翰·霍爾梅，尼沙·吉恩，
申請(專利權)人：LGC基因組學有限公司，
類型：發明
國別省市：英國;GB