肌張力障礙VPS16基因的檢測引物、方法和試劑盒技術

本發明專利技術提供了一種肌張力障礙VPS16基因的檢測引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2。本發明專利技術的上述引物，可以實現對標樣DNA直接擴增得出VPS16基因進行分析判斷，克服了現有TOR1A、THAP1、GCH1等突變檢測的片面性，并且過程直接通過普通PCR方法即可實現，具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優點；檢測結果可以為肌張力障礙的早期診斷、鑒別診斷及開發肌張力障礙治療藥物提供科學輔助。

【技術實現步驟摘要】
肌張力障礙VPS16基因的檢測引物、方法和試劑盒
本專利技術屬于分子生物工程
，具體涉及一種肌張力障礙VPS16基因的檢測引物、方法和試劑盒。
技術介紹
肌張力障礙是繼特發性震顫、帕金森疾病的第三大常見運動障礙性疾病，其臨床表現為由于主動肌和拮抗肌收縮不協調，或過度收縮引起的異常動作和姿勢，具有不自主性和持續性的特點。目前針對中國肌張力障礙人群的研究中，已發現的致病基因如TOR1A、THAP1、GCH1等，但僅能解釋不足5％的病例；因此通過現有致病基因的檢測還不能準確地對疑似患病的患者是否患病進行準確判斷。
技術實現思路
本專利技術實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種克服現有現有TOR1A、THAP1、GCH1等突變檢測的片面性的肌張力障礙VPS16基因的檢測引物、方法和試劑盒。為了實現上述專利技術目的，本專利技術實施例的技術方案如下：一種肌張力障礙VPS16基因的檢測引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2。本專利技術的上述引物，可以實現對標樣DNA直接擴增得出VPS16基因進行分析判斷，克服了現有TOR1A、THAP1、GCH1等突變檢測的片面性，并且過程直接通過普通PCR方法即可實現，具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優點；檢測結果可以為肌張力障礙的早期診斷、鑒別診斷及開發肌張力障礙治療藥物提供科學輔助。本專利技術進一步還提出采用上述引物進行檢測的方法，包括如下步驟：獲取待測DNA標樣；將待測DNA標樣通過如具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2進行PCR擴增，得到擴增產物；將所述擴增產物進行測序。本專利技術的另一目的還在于提出一種肌張力障礙VPS16基因的檢測試劑盒，在試劑盒中包含有上述肌張力障礙VPS16基因的檢測引物。采用本專利技術的上述檢測方法和檢測的試劑盒，通過實現擴增VPS16基因然后進行測序，最終通過與正常標準基因庫中的VPS16基因序列進行比對，查看第156位點的堿基是否由C突變為A；從而進行結果判斷，具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優點。附圖說明下面將結合附圖及實施例對本專利技術作進一步說明，附圖中：圖1為本專利技術實施例中采樣的肌張力障礙遺傳家系圖譜；圖2為本專利技術肌張力障礙VPS16基因的檢測方法的檢測結果峰圖。具體實施方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。本專利技術實施例提供一種肌張力障礙VPS16基因的檢測方法，包括如下步驟：S10，制備待測DNA樣本；S20，以待測DNA樣本為模板，通過PCR擴增待測DNA樣本的VPS16基因；S30，將PCR擴增產物進行測序，并將測序的結果與基因庫中的VPS16基因進行對比，驗證第156位點的核苷酸堿基是否由C突變為A；其中步驟S20的PCR過程中采用的引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2。引物名稱序列長度序列號編號上游引物P1GAAGACAAATGGAGGCTTTAGG22bpSEQ.ID.No.1下游引物P2ACTGCAGGGGAGAGAGGTTC20bpSEQ.ID.No.2本專利技術通過以一個常染色體隱性遺傳的肌張力障礙家系的研究，患者III5的父母(II4和II5)為近親結婚但表現正常，在世的四位患者均表現為早期發病，頭頸不自主運動，軀體扭轉，生活不能自理，經初步臨床癥斷為原發性肌張力障礙。在家系中選取所有在世的患者作為研究樣本，II4和II5作為正常樣本對照，進行外顯子測序。具體測序采用利用NimbleGenSeqCapEZExome64M全外顯子捕獲Kit結合Hiseq2000高通量測序平臺，平均獲得133392SNPs和10797Indels。隨后通過dbSNP數據庫、千人基因組數據庫、HapMap數據庫等公共數據庫的過濾，去掉所有已知的且在數據庫中等位基因頻率大于0.005的變異。通過比對正常樣本，去掉所有已知變異，同義突變以及非編碼區的變異，并利用SIFT軟件進行SNP功能預測，最終得到2個可能引起致病的基因突變。進一步運用Sanger測序的方法，對這兩個基因上的侯選突變位點進一步驗證，發現VPS16基因的c.156C>A純合突變在家系中共分離，該突變導致編碼的第52位氨基酸發生p.Asn52Lys錯義突變。而200個正常人并不攜帶此純合的基因突變，因此這個純合的基因突變導致疾病。最終通過自主構建了VPS16c.156C>A雜合和純合突變小鼠，以及VPS16雜合和純合敲除小鼠進行對比驗證。在對比缺失VPS16的小鼠肌張力及活動異常，相對于正常對照小鼠，在轉輪疲勞儀運動的時間明顯縮短，通過步態分析系統發現其四肢活動均有異常。因此最終確定VPS16c.156C>A確為疾病發生關聯基因。因此在上述情形下，本專利技術中采用針對特異性設計的引物，擴增待測DNA樣本的VPS16基因，然后對突變位點進行鑒定。在實施過程中步驟S10中DNA樣本的獲取可以從采集的外周血，對外周血樣本中采用OMEGABloodDNAMidiKit全血DNA提取試劑盒從外周血樣品中提取DNA。步驟S10完成后，將提取基因組DNA用分光光度計測DNA含量，測定濃度和純度；進而在步驟S20中選擇提取濃度和純度較好的DNA標樣進行PCR擴增，當然其中引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2。最終步驟S30將步驟S20以特異性引物擴增得到的VPS16基因進行測序。當然在測序之前更加優選的步驟還可以將步驟S20的擴增產物進行純化，純化的方式可以采用凝膠電泳和/或millipore純化板進行。純化步驟可以去除RNA、鹽離子等雜質，提高擴增片段純度。雖然測序擴增產物的純化不是實現本專利技術所必須，但純化測序擴增產物可以有利于測序反應的精確度。并進一步通過測序的結果，與正常標準基因庫中的VPS16基因序列進行比對，查看第156位點的堿基是否由C突變為A。本專利技術中在發現VPS16c.156C>A這一關聯基因后，通過引物對標樣DNA直接擴增得出VPS16基因進行分析判斷，克服了現有TOR1A、THAP1、GCH1等突變檢測的片面性，并且過程直接通過普通PCR方法即可實現，具有快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高等優點；檢測結果可以為肌張力障礙的早期診斷、鑒別診斷及開發肌張力障礙治療藥物提供科學輔助。本專利技術進一步提出一種肌張力障礙VPS16基因的檢測的引物、以及試劑盒。其中檢測的引物當然為具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2。試劑盒中除了可以具有上述引物之外，還可以包含PCR反應緩沖液如2×GCBuffer、酶液如LATaq酶、以及標準正常VPS16基因測序峰圖的陽性對照等等。為使本專利技術上述引物、方法和試劑盒使用的細節更容易被技術人員理本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肌張力障礙VPS16基因的檢測引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2。

【技術特征摘要】
1.一種肌張力障礙VPS16基因的檢測引物在用于制備肌張力障礙的檢測試劑盒中的用途，其特征在于，包括如下步驟：獲取待測DNA標樣；將待測DNA標樣通過肌張力障礙VPS16基因的檢測引物進行PCR擴增，得到擴增產物，其中，肌張力障礙VPS16基因的檢測引物包括序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物P1和序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物P2，其中，所述肌張力障礙VPS16基因相較于基因庫VPS16基因存在c.156C>A；將所述擴增產物進行測序。2.如權利要求1所述的肌張力障礙VPS16...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李維平，蔡曉東，吳松，劉文蘭，張協軍，陳欣，何思捷，劉歡，張建國，徐訊，
申請(專利權)人：深圳市第二人民醫院，深圳華大基因科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44