生物膜抑制肽及其應用制造技術

本發明專利技術公開了生物膜抑制肽及其應用，生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其制備方法簡單，能夠通過常規的固相合成方法進行合成，純化后的生物膜抑制肽能夠抑制表皮葡萄球菌生物膜形成和表面粘附，能夠與其他抗菌藥物聯合應用于抑制耐藥性表皮葡萄球菌，對臨床治療表皮葡萄球菌感染具有重要意義。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫藥領域，具體涉及生物膜抑制肽，還涉及生物膜抑制肽的應用。
技術介紹
以表皮葡萄球菌(Staphylococcus?epidermidis)為代表的病原菌常黏附于植入或侵襲性操作的醫療器械表面，包括導管、假體、人工心臟瓣膜、人工關節等，并形成細菌生物膜(Bacterial?biofilm，BF)。與浮游細菌不同，BF細胞間有著嚴密的化學信號傳導交流信息，并建立致密的三維立體空間結構，該結構能逃避宿主免疫系統的攻擊，并對抗生素產生耐藥性，在臨床上常表現為遷延不愈，造成了極大的臨床危害。然而，目前針對表皮葡萄球菌感染缺少有效的防治手段。因此，急需一種對表皮葡萄球菌的BF形成具有抑制作用的藥物，為臨床治療耐藥性表皮葡萄球菌感染奠定了基礎。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的之一在于提供生物膜抑制肽，為表皮葡萄球菌感染提供新的藥物；本專利技術的目的之二在于提供生物膜抑制肽在制備抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的藥物中的應用；本專利技術的目的之三在于提供生物膜抑制肽在制備抑制表皮葡萄球菌表面粘附的藥物中的應用。為實現上述專利技術目的，本專利技術提供如下技術方案：1、生物膜抑制肽，所述生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。2、所述的生物膜抑制肽在制備抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的藥物中的應用。優選的，所述表皮葡萄球菌為表皮葡萄球菌ATCC35984。3、所述的生物膜抑制肽在制備抑制表皮葡萄球菌表面粘附的藥物中的應用。優選的，所述表皮葡萄球菌為表皮葡萄球菌ATCC35984。本專利技術的有益效果在于：本專利技術公開了生物膜抑制肽，該多肽是基于β-內酰胺酶抑制蛋白與β-內酰胺酶之間空間結構，通過計算機分子三維模擬設計構建的多肽分子，對獲得的多肽分子進行對生物膜的抑制研究，結果顯示生物膜抑制肽能夠明顯抑制表皮葡萄球菌BF的形成和表面粘附，此結果提示β-內酰胺酶和BF之間或是各種耐藥機制之間存在相關聯系，但需進一步深入研究。由于生物膜抑制肽具有抑制表皮葡萄球菌BF的形成和表面粘附，所以可以與其他抗菌藥物聯合用于耐藥性表皮葡萄球菌感染的治療，為表皮葡萄球菌感染的治療提供新的候選藥物。附圖說明為了使本專利技術的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本專利技術提供如下附圖：圖1為生物膜抑制肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的生長曲線。圖2為結晶紫法測定生物膜抑制肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制效果。圖3為結晶紫法測定生物膜抑制肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制作用的OD值(注：*表示與對照組比較P<0.05；**表示與對照組比較P<0.01)。圖4為激光共聚焦檢測生物膜抑制肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的BF抑制作用×40(A為對照組，粘附的細菌較多，形成的BF結構致密；B為生物膜抑制肽組，粘附的細菌較少，結構較為疏松)。圖5為結晶紫法測定生物膜抑制肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的粘附作用(注：**表示與對照比較P<0.01)。具體實施方式下面將結合附圖，對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。本專利技術以下實施例使用的菌株為表皮葡萄球菌ATCC35984，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基、異硫氰酸熒光素標記的刀豆球蛋白(FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)購自美國Sigma公司，Mueller-Hinton(MH)肉湯培養基購自北京陸橋公司，CS136XT多肽合成儀購自美國CSBio公司，E2695分析型高效液相色譜儀購自美國Waters公司，LC6000制備型高效液相色譜儀購自北京創新通恒公司，Autoflex?Speed質譜儀購自德國Bruker公司，Multiskan?spectrum酶標儀購自美國Thermo公司，LSM?780激光共聚焦購自德國ZEISS公司。實施例1、合成生物膜抑制肽生物膜抑制肽(以下簡稱PT-8多肽)含有8個氨基酸殘基，其序列為：Pro?Tyr?Gly?Gly?Phe?Ser?Phe?Thr(PYGGFSFT)(SEQ?ID?NO.1)，利用人工標準固相合成方案，在固相多肽合成儀上進行，固相支持劑為樹脂，流動相為二甲基甲酰胺/二氯甲烷(1：1)。經過多步反應合成如SEQ?ID?NO.1所示的多肽。合成肽使用LC6000高效液相色譜儀，C18柱(Kromasil?20×250mm?C18120A)進行純化，收集產物峰獲得純度96.8％的PT-8多肽，真空干燥，稱量，20mg/瓶分裝，-20℃保存備用。然后進行質譜鑒定，分子量為874.4Da，結果表明ESI-MS?m/z:875.5[M+H]和438.25[M+2H]，PT-8的分子離子峰與合成預期結果一致。實施例2、PT-8多肽抑菌試驗(1)微量肉湯稀釋法測定PT-8多肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的最低抑菌濃度(MIC)取表皮葡萄球菌ATCC35984接種于哥倫比亞血平板上，在37℃培養24h后挑取單個菌落于裝有10ml?MH肉湯的錐形瓶中，37℃振搖24h，然后收集菌液并將菌液稀釋至106CFU/ml，將稀釋后的菌液分別接種于96孔板中，每孔100μL，再加入實施例1合成的多肽至終濃度分別為256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml和1μg/ml，并控制終體積為200μL，MH肉湯為空白對照，然后置于37℃、5％CO2條件下培養24h，肉眼觀察以抑制細菌生長的最低藥物濃度作為MIC值，同一濃度水平重復3次。結果顯示，PT-8多肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的MIC值大于256μg/ml，說明PT-8多肽對表皮葡萄球菌細菌ATCC35984無直接抑菌作用。(2)測定PT-8多肽對表皮葡萄球菌ATCC35984的生長曲線取表皮葡萄球菌ATCC35984接種于哥倫比亞血平板上，在37℃培養24h后挑取單個菌落于裝有10ml?TSB培養基的錐形瓶中，37℃振搖24h，然后收集菌液并將菌液稀釋至106CFU/ml，將稀釋后的菌液分別接種于24孔板中，每孔500μL，再加入500μL實施例1合成的多肽至終濃度為256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml和16μg/ml的PT-8的TSB培養基，于37℃下同時培養，每2h測量菌液在600nm波長下的吸光度值。根據測定結果以菌液600nm波長下的吸光度值OD600為縱本文檔來自技高網...

【技術保護點】
生物膜抑制肽，其特征在于：所述生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術特征摘要】
1.生物膜抑制肽，其特征在于：所述生物膜抑制肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.權利要求1所述的生物膜抑制肽在制備抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述表皮葡萄球菌...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳勇川，孫鳳軍，歐陽凈，熊麗蓉，馮偉，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：重慶;85