新的殺蟲蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表達、生產(chǎn)所述肽的方法、新的處置方法、生產(chǎn)技術(shù)、新的肽、新的制劑和新的生物、提高來自酵母表達系統(tǒng)的殺蟲肽生產(chǎn)產(chǎn)量的方法。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及并公開了選定的我們稱為富含半胱氨酸的殺蟲肽(CRIPS)的內(nèi)毒素，其是來源于蘇云金芽孢桿菌(Bt)的肽及其基因，以及內(nèi)毒素與稱為抑制物胱氨酸結(jié)(ICK)基因和肽的毒肽的組合、以及內(nèi)毒素與其它類型的殺蟲肽例如胰蛋白酶調(diào)節(jié)抑卵因子(TMOF)肽序列的組合，它們用于基因和肽兩者的各種制劑和組合，用于控制昆蟲。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】相關(guān)申請的引用本申請是PCT申請，其要求早期在2012年3月9日提交的美國臨時申請順序號61/608,921、2012年5月8日提交的美國臨時申請順序號61/644,212、2012年9月7日提交的美國臨時申請順序號61/698,261和2012年11月26日的美國臨時申請順序號61/729,905的權(quán)益，所述申請的完整內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。專利
描述并要求保護新的殺蟲蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表達、生產(chǎn)所述肽的方法、新的處置方法、生產(chǎn)技術(shù)、新的肽、新的制劑和產(chǎn)生比用于昆蟲控制的相關(guān)肽所預(yù)期的更高產(chǎn)量的新的和已知生物體的組合。專利技術(shù)背景通過現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)的食物的全球安全性受到蟲害的挑戰(zhàn)。農(nóng)民依靠殺蟲劑來抑制蟲害，然而由于從市場中清除危險化學(xué)物質(zhì)以及對所有主要類別的化學(xué)和生物殺蟲劑有抗性的昆蟲品系的進化，農(nóng)民可獲得的對安全實用的殺蟲劑的商業(yè)選擇正在縮小。新的殺蟲劑對農(nóng)民維持作物保護是必需的。殺蟲肽是對其目標(通常為某種類型的昆蟲或蜘蛛類動物)有毒的肽，所述肽常常可具有節(jié)肢動物起源，例如來源于蝎或蜘蛛。所述肽可遞送到內(nèi)部，例如通過注射將毒素直接遞送到昆蟲的腸或內(nèi)部器官，或通過誘使昆蟲從其食物中食入毒素，例如昆蟲攝食轉(zhuǎn)基因植物，和/或當通過將毒素散布在昆蟲居住的場所將毒素遞送給昆蟲，或通過噴灑或其它方法將毒素遞送至昆蟲的環(huán)境，然后昆蟲與所述肽有某種形式的接觸時，所述肽可具有抑制生長、損害運動或甚至殺死昆蟲的能力。然而，殺蟲肽進入市場時有很大的問題，迄今很少(如有的話)殺蟲肽獲準并在市場上銷售，只有一個著名的例外，即來源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillis?thuringiensis)或Bt的肽。目前在昆蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性方面存在顧慮。Bt蛋白，或Bt肽，是以植物結(jié)合殺蟲劑(plant?incorporated?protectant)和葉面噴撒兩種形式用于作物保護的有效殺蟲劑。Bt蛋白的商業(yè)制劑廣泛用于控制幼蟲期的昆蟲。ICK肽包括具有殺蟲活性的許多分子。所述ICK肽對天然存在的生物目標物種(通常為某種類型的昆蟲或蜘蛛類動物)常常是有毒的。通常ICK肽可具有節(jié)肢動物起源，例如蝎或蜘蛛的毒液。Bt是一種并且是唯一的商用殺蟲肽的來源生物。已鑒定出潛在的其它類別和類型的肽，例如胰蛋白酶調(diào)節(jié)抑卵因子(Trypsin?modulating?oostatic?factor，TMOF)肽。TMOF肽以各種方式被遞送到它們的生理作用部位，并且TMOF肽被鑒定為具有極大潛力的潛在殺幼蟲劑，參見D.?Borovsky，Journal?of?Experimental?Biology?206，3869-3875，但像幾乎所有的其它殺蟲肽一樣，TMOF未被商業(yè)化或未被農(nóng)民廣泛使用，并且有理由如此。具有可再現(xiàn)的肽形成和折疊，以合理和經(jīng)濟的價格，在商業(yè)規(guī)模上成功生產(chǎn)殺蟲肽的能力可能受到挑戰(zhàn)。殺蟲肽種類繁多、性能獨特且性質(zhì)特殊，結(jié)合極其多種的生產(chǎn)技術(shù)，可提供肽應(yīng)用和生產(chǎn)的眾多方法，但很少(如有的話)是商業(yè)上成功的。為什么已鑒定的眾多殺蟲肽中如此少量已被推向市場有幾個原因。第一，大多數(shù)殺蟲肽足夠脆弱或毒性不足而難以商用。第二，殺蟲肽難以商業(yè)化生產(chǎn)且昂貴。第三，許多殺蟲肽快速降解并且半壽期短。第四，當通過植物表達時，極少殺蟲肽正確折疊，因此在遺傳修飾生物體(GMO)中失去其毒性。第五，大多數(shù)已鑒定的殺蟲肽當被昆蟲采食時，在昆蟲中的全身分布被阻斷和/或喪失其毒性性質(zhì)。Bt蛋白是最后這個問題的例外，并且因為它們擾亂昆蟲攝食，因此被廣泛使用。在此，我們提出對于阻礙殺蟲肽的商業(yè)化和廣泛使用的這些主要問題的幾個解決方法。在第一部分中，我們描述了如何產(chǎn)生允許植物產(chǎn)生和表達保持對昆蟲的毒性的正確折疊的殺蟲肽的特殊表達盒和系統(tǒng)。在第二部分中，我們描述了如何對肽的組成產(chǎn)生相對小的改變，并如此進行以顯著提高可通過發(fā)酵生產(chǎn)的速率和量。該處置方法還同時降低商業(yè)化工業(yè)肽生產(chǎn)的成本。該部分教導(dǎo)了如何可將蛋白質(zhì)“轉(zhuǎn)化”成不同的更有成本效益的肽，所述肽可以更高產(chǎn)量生產(chǎn)，并且出人意料地仍具有與轉(zhuǎn)化前恰好一樣的毒性。在第三和最后的部分中，我們描述了如何將不同類別的殺蟲肽組合在一起，使得它們可以協(xié)同方式一起運作以顯著改變并提高與其各個組分相比時組分肽的毒性和活性。該部分還提供支持我們的系統(tǒng)、方法和肽組合和制劑的詳細資料和數(shù)據(jù)以應(yīng)付正在逼近的Bt抗性昆蟲的發(fā)生和散布的威脅。Bt抗性昆蟲代表了下一個對全球食物供應(yīng)的巨大威脅，我們教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員如何迎接和戰(zhàn)勝這種威脅。專利技術(shù)概述本專利技術(shù)描述了如何在植物中產(chǎn)生毒性殺蟲肽，因此當它們通過植物表達時正確折疊。本專利技術(shù)描述了如何使用各種載體在實驗室和商業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中生產(chǎn)高產(chǎn)量的肽。本專利技術(shù)描述了一個類別的毒性殺蟲肽，我們稱為CRIPS，其表示富含半胱氨酸的殺蟲肽(Cysteine?Rich?Insecticidal?Peptides，CRIPS)。本專利技術(shù)描述了另一個類別的毒性殺蟲肽，我們稱為PFIPS，其表示成孔殺蟲蛋白(Pore?Forming?Insecticidal?Proteins，PFIPS)。本專利技術(shù)描述了如何可將CRIPS和PFIPS的新的協(xié)同組合制備在一起并用于各種目的，包括保護作物免遭Bt或蘇云金芽孢桿菌肽抗性昆蟲。我們公開了如何制備和使用CRIPS和PFIPS的組合以非常低的劑量殺死和控制昆蟲，甚至Bt抗性昆蟲。雖然不受理論約束，但是我們對Bt或蘇云金芽孢桿菌肽和蛋白質(zhì)的理解，可供我們教導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員建立保護植物和控制昆蟲的新的方法、組合物、化合物(蛋白質(zhì)和肽)和程序。我們描述并要求保護包含與富含半胱氨酸的殺蟲蛋白(CRIP)?(例如抑制物半胱氨酸結(jié)(Inhibitor?Cysteine?Knot，ICK)基序蛋白)有效連接的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽(ERSP)的蛋白質(zhì)，其中所述ERSP是所述蛋白質(zhì)(ERSP-ICK)的N端。一種肽，其中所述ERSP是將表達的CRIP導(dǎo)向植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的任何信號肽。一種肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨酸結(jié)(ICK)蛋白。一種肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。一種肽，其中所述ERSP是來源于植物的長度為5-50個氨基酸的肽。一種與翻譯穩(wěn)定性蛋白(Translational?Stabilizing?Protein，STA)有效連接的肽，其中所述ERSP是所述蛋白質(zhì)的N端，翻譯穩(wěn)定性蛋白(STA)可在CRIP的N端一側(cè)，所述CRIP任選為ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白(ERSP-STA-非ICK)；或在ICK或非ICK基序蛋白的C端一側(cè)(ERSP-ICK-STA)或(ERSP-非ICK-STA)。我們描述并要求保護具有添加至已知肽并與所述已知肽有效連接的N端二肽的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一個非極性氨基酸和二肽C端的一個極性氨基酸組成，其中所述肽選自CRIP?(富含半胱氨酸的殺蟲肽)，例如選自ICK肽或非ICK肽。一種具有添加至已知肽并與所述已知肽有效連接的N端二肽的肽，其中N端二肽由二肽N端的一個非極性氨基酸和二肽C端的一個極本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種包含與富含半胱氨酸的殺蟲蛋白(CRIP)例如抑制物半胱氨酸結(jié)(ICK)基序蛋白有效連接的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽(ERSP)的蛋白質(zhì)，其中所述ERSP是所述蛋白質(zhì)(ERSP?ICK)的N端。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2012.03.09 US 61/608921;2012.05.08 US 61/644212;201.一種包含與富含半胱氨酸的殺蟲蛋白(CRIP)例如抑制物半胱氨酸結(jié)(ICK)基序蛋白有效連接的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽(ERSP)的蛋白質(zhì)，其中所述ERSP是所述蛋白質(zhì)(ERSP-ICK)的N端。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述ERSP是將表達的CRIP導(dǎo)向植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的任何信號肽。
3.權(quán)利要求2的肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨酸結(jié)(ICK)蛋白。
4.權(quán)利要求2的肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。
5.權(quán)利要求2的肽，其中所述ERSP是來源于植物的長度為5-50個氨基酸的肽。
6.一種與翻譯穩(wěn)定性蛋白(STA)有效連接的權(quán)利要求1的肽，其中所述ERSP是所述蛋白質(zhì)的N端，翻譯穩(wěn)定性蛋白(STA)可在任選為ICK基序蛋白(ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白(ERSP-STA-非ICK)的CRIP的N端一側(cè)；或者在ICK或非ICK基序蛋白(ERSP-ICK-STA)或(ERSP-非ICK-STA)的C端一側(cè)。
7.一種具有添加至已知肽并與所述已知肽有效連接的N端二肽的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一個非極性氨基酸和二肽C端的一個極性氨基酸組成，其中所述肽選自CRIP?(富含半胱氨酸的殺蟲肽)，例如選自ICK肽或非ICK肽。
8.一種具有添加至已知肽并與所述已知肽有效連接的N端二肽的權(quán)利要求7的肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一個非極性氨基酸和二肽C端的一個極性氨基酸組成。
9.權(quán)利要求8的肽，其中所述來自N端二肽的N端氨基酸的非極性氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。
10.權(quán)利要求8的肽，所述N端肽的C端氨基酸的極性氨基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、色氨酸、酪氨酸。
11.權(quán)利要求8的肽，其中所述來自N端二肽的N端氨基酸的非極性氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，所述N端肽的C端氨基酸的極性氨基酸選自...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：RM肯尼迪，W特德福德，C亨德里克森，R維納布爾，C富涅，J麥金泰爾，A卡爾森，鮑林，
申請(專利權(quán))人：韋斯塔隆公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US
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