本發明專利技術涉及一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，包括下列步驟：(1)基礎層析介質與三氯三氮嗪反應活化后，分別與L-纈氨酸以及對氨基苯磺酸反應，合成仿生親和分離材料；(2)用制備的仿生親和分離材料純化糜蛋白酶原，將含有糜蛋白酶原的樣品流過該親和層析柱，糜蛋白酶原吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，將結合的糜蛋白酶原洗脫下來。(3)用胰蛋白酶進行糜蛋白酶原的激活。本發明專利技術能夠高效率、低成本的大規模生產高酶活的糜蛋白酶。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及的是一種生物醫藥
的純化方法。特別是一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶的純化方法。
技術介紹
糜蛋白酶是從胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理及臨床上的功用主要有1.用于創傷或手術后傷口愈合、抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血腫、乳房手術后浮腫、中耳炎、鼻炎等。2.對眼球睫狀韌帶有選擇性松解作用，可用于白內障摘除，使晶狀體比較容易地移去。3.使粘稠的痰液稀化，便于咳出，對膿性和非膿性痰液均有效。 在動物胰臟中含有大量的酶，大多數以酶原非活性的形式存在，經胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，此外在動物胰臟中大部分的酶為絲氨酸蛋白酶家族，特別是胰蛋白酶原與糜蛋白酶原的理化性質相近，難以將二者分離。目前國際上通用的動物組織提取藥用蛋白工藝是基于傳統的鹽析、沉淀等方式，這種工藝提取特異性差，操作過程目標產品損失大，以這種傳統工藝生產的產品活性一般在800-1000單位/毫克，最高只能達到1200單位/毫克左右。從市場上采購的通用純化介質和純化技術，如超濾、分子篩凝膠層析、離子交換凝膠層析、疏水凝膠層析。由于這些純化介質和方法的純化效率低、往往需要多介質與多個步驟組合才能達到產品質量要求，生產步驟的增多導致產品總回收率降低，生產成本升高,純化工段成本可高達總生產成本60% -80%。加之這類介質多由國際公司定價并且每年以15%提價，造成蛋白純化工藝升級慢，工藝成本高，難以形成產業化，嚴重制約資源的充分利用。 經對現有技術文獻的檢索發現，從動物胰臟中提取純化糜蛋白酶的方法有多種，多為硫酸銨沉淀，陽離子交換和陰離子交換層析，超濾等，如中國專利102618523A—種糜蛋白酶的純化；中國專利101302505A —種分離提取糜蛋白酶的方法；由于采用多步提取純化，導致糜蛋白酶的回收率低，酶活性不高；有專利報道采用親和層析技術進行糜蛋白酶的純化，如中國專利1807612A —種糜胰蛋白酶的制備方法，以卵粘蛋白作為親和配基，由于這種親和配基成本較高，且使用壽命較短，糜蛋白酶的生產成本高，不利于工業上的放大進行。 因此，有必要開發效率高、成本低、生產步驟更簡便的糜蛋白酶原分離材料和和生產工藝。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供一種糜蛋白酶原仿生親和材料及糜蛋白酶的純化方法，使其克服糜蛋白酶大規模純化中的缺點，在大規模分離純化時步驟少、成本低、效率高，利用糜蛋白酶原專一的親和配位體，可快速、簡便、低成本、大批量純化糜蛋白酶。 因此本專利技術的目的在于提供糜蛋白酶原特異性的親和配基，制備糜蛋白酶原仿生親和材料； 本專利技術的另一個目的在于建立糜蛋白酶層析純化方法，保證在大規模分離純化時，高效的提取糜蛋白酶。 本專利技術是通過以下技術方案實現的，本專利技術以基礎層析介質為原料制備仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化糜蛋白酶原。 本專利技術包括以下步驟 (I)在基礎層析介質上進行固相合成，制備仿生親和分離材料； 合成糜蛋白酶原專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎層析介質，或用常規化學方法對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，然后與L-纈氨酸和對氨基苯磺酸反應，合成親和分離材料。 (2)用制備的仿生親和分離材料純化糜蛋白酶； 用上述合成的親和層析介質制備成親和層析柱，將胰臟提取液上清流過該親和層析柱，糜蛋白酶原吸附在親和層析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變換緩沖液條件將結合的糜蛋白酶原洗脫下來，得到高純糜蛋白酶原。 (3)糜蛋白酶原激活。 洗脫下來的糜蛋白酶原經胰蛋白酶激活后，即得到糜蛋白酶。 在步驟(I)中，基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中的一種。 在步驟(2)中，親和介質吸附糜蛋白酶原的條件為PH6-7，離子強度為0.0-0.3M的緩沖液；洗雜條件為PH6-7，離子強度為0.05M的緩沖液；洗脫條件為PH6-7，離子強度為0.5-1.0M的緩沖液。 在步驟(3)中，糜蛋白酶原激活的條件為pH7.6，按照(I: 10) (L:mg)比例加入胰蛋白酶，4°C，激活24-48h。 所述的仿生親和分離材料，其結構是通過三氮嗪結構骨架作為間臂固定L-纈氨酸及對氨基苯磺酸基團。 [0021 ] 所述的糜蛋白酶原，其原料為哺乳動物胰臟。 本專利技術克服了糜蛋白酶生產技術中的缺點，使糜蛋白酶生產分離純化時步驟少，生產成本低，生產效率高，利用糜蛋白酶原專一的親和分離材料，可快速、簡便、低成本、大批量純化糜蛋白酶。糜蛋白酶一步純化的回收率> 60%，酶活> 1500U/mg，CT/T > 10。 【附圖說明】 圖1:1_氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸-5-氨基苯磺酸-2,4,6-三氮嗪純化糜蛋白酶原SDS-PAGE檢測結果。 【具體實施方式】 本領域技術人員可以對本專利技術作各種改動或修改,如起始材料NH2-Sepharose可以更換成葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠等，這些等價形式同樣落于本專利技術的范圍。 下面結合具體實例做進一步的闡述: 實施例1 一分離材料制備 取NH2-Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗滌后，抽干轉移至反應器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(I?5g)，用飽和NaHCO3調節反應系統的pH在6?7之間，反應3小時后取出，依次用3X10倍體積的水/丙酮(O: 1,1: 3,1: 1,3: 1,1: O)洗滌，得到1-氨基-Sepharose-3, 5_ 二氯-2,4,6_ 三氮嗪。 稱取L-纈氨酸(3?5g)用去離子水溶解，與介質1-氨基-S印harose-3，5_ 二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調節pH在6?7之間，置于溫度50°C中攪拌反應24小時。反應結束后，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1_氨基-S印harose-3-纈氨酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20 %乙醇儲存待用。 取介質1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸-5-氯-2,4,6-三氮嗪(30mL),并稱取對氨基苯磺酸(3?5g)，用二甲亞砜和去離子水混合溶解，將溶液的pH調至5?8左右，較佳的pH7,倒入反應器與介質1-氨基-Sepharose-3-纟顏氨酸_5_氯-2,4,6-三氮嗪混勻,放于溫度為95°C的恒溫環境下攪拌反應60小時。反應結束后，取出反應物，用4倍體積的NaCl，3倍體積的二甲亞砜洗滌，然后用10倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基S印harose-3-纈氨酸-5-氨基苯磺酸_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20 %乙醇儲存待用。 二用親和分離材料純化糜蛋白酶原 選取新鮮冷凍的牛胰臟50g，將脂肪、結締組本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征在于，包括下列步驟：?(1)仿生親和分離材料結構是在基礎層析介質上通過三氮嗪骨架作為間臂固定L?纈氨酸及對氨基苯磺酸；?(2)用制備的仿生親和分離材料純化胰臟提取液上清；?(3)用胰蛋白酶進行糜蛋白酶原的激活，得到糜蛋白酶。
【技術特征摘要】
1.一種糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)仿生親和分離材料結構是在基礎層析介質上通過三氮嗪骨架作為間臂固定卜纈氨酸及對氨基苯磺酸； (2)用制備的仿生親和分離材料純化胰臟提取液上清； (3)用胰蛋白酶進行糜蛋白酶原的激活，得到糜蛋白酶。2.根據權利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，步驟(1)中，基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和IV-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中的一種。3.根據權利要求1所述的糜蛋白酶原仿生親和材料的制備及糜蛋白酶純化方法，其特征是，在步驟(2)中，親和介質吸附糜蛋白酶原的條件為為1)116-8，離子強度...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李榮秀，馬貴軍，翟東改，陽成成，
申請(專利權)人：上海亨臻實業有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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