一株水解米渣的蛋白酶產生菌——解淀粉芽孢桿菌及其篩選與使用方法技術

本發明專利技術公開了一株水解米渣的蛋白酶產生菌——解淀粉芽孢桿菌及其篩選和使用方法，該解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）菌株純培養物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60，保藏編號為CCTCC?NO.M?2014200。通過初篩和復篩篩選得到目標菌株。取斜面保藏菌株培養之后，即直接用于米渣中蛋白質的水解。解淀粉芽孢桿菌HP60用于米渣蛋白水解，水解度可達15.63％。該菌株成本低、能循環利用、穩定性好、綠色安全、能直接用于生物催化，原料來源廣泛，方法簡單實用。因此，該菌株具有重要應用前景，該菌株可應用于其他蛋白質的水解。

【技術實現步驟摘要】
一株水解米渣的蛋白酶產生菌——解淀粉芽孢桿菌及其篩選與使用方法
本專利技術涉及微生物或酶，特別涉及蛋白酶產生菌。
技術介紹
稻谷，在植物學上屬禾本科稻屬普通栽培稻亞屬種的普通稻亞種，是全球第一大糧食品種。稻谷的年均產量大約占到了全國糧食總產量的2/5，達到了1.90億t。米渣是以早秈米、碎米、陳化米等為原料進行發酵和生產糖漿、味精、生化藥品等過程中被過濾掉米漿后剩下的殘渣，價格低廉，產量巨大，在大米淀粉糖的生產過程中每消耗7t大米就要產生1t米渣。米渣中蛋白質含量約為40％～70％，相當于稻谷中蛋白質含量的5～8倍，其含量接近大豆，而且氨基酸配比符合WHO/FAO推薦的理想模式，其品質被公認為糧食種子蛋白中的最佳者。但是這些優質的蛋白質資源大部分都以干粉的形式廉價的賣給了飼料廠做飼料，并沒有得到深度開發和利用，若將這些米渣蛋白資源轉化成具有高附加值的氨基酸和多肽，不但能提高其生物效價、經濟價值，對提高我國稻谷深加工的技術含量，以及促進整個糧食產業的發展都有著深遠的影響。蛋白質經酸、堿或者蛋白酶處理可獲得氨基酸和多肽。酸、堿水解作用強烈會破壞一些敏感氨基酸，并且生成有毒的氯丙醇類物質。酶水解條件溫和，對敏感氨基酸無破壞，能最大保留原料理化性質、風味、功能特性、綠色安全，能耗小。可是目前多數利用商品蛋白酶水解蛋白質，這使得工業化生產成本較高，因此，篩選蛋白酶產生菌尤為重要。目前中國專利數據庫中，涉及蛋白酶產生菌的專利申請件不多，僅有ZL2010101038046號《一種耐有機溶劑蛋白酶產生菌及其所產耐有機溶劑蛋白酶的基因和應用》、2007101919691號《一種耐有機溶劑堿性蛋白酶產生菌以及該耐有機溶劑堿性蛋白酶的基因和應用》和2013101991045號《一種膠原蛋白酶產生菌》。至今為止，尚無涉及水解米渣的蛋白酶產生菌的申請件。
技術實現思路
本專利技術旨在提供一株水解米渣的蛋白酶產生菌——解淀粉芽孢桿菌，使之能夠用于米渣蛋白的生物法水解。本專利技術的又一目的是提供上述解淀粉芽孢桿菌的篩選方法及使用方法，使其具備特定的工業用途。專利技術人提供的水解米渣的蛋白酶產生菌是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，該菌株純培養物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60，保藏單位地址：中國武漢·武漢大學430072，保藏編號為CCTCCNO.M2014200。該菌株系從中國貴州傳統豆豉中分離得到。上述解淀粉芽孢桿菌HP60的形態特征和生理生化特征接近芽孢桿菌屬，解淀粉芽孢桿菌HP60的16SrRNA序列與Genbank中已知Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumstr.FZB42NC009725.1序列同源性在99％以上，看家基因recA與BacillusamyloliquefaciensIT-45（CP004065.1）、BacillusamyloliquefaciensLFB112（CP006952.1）等9株同源性達99％。根據≤伯杰氏系統細菌學手冊≥中芽孢桿菌屬的分類概況，HP60屬芽孢桿菌綱（Bacilli）,芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae）,芽孢桿菌屬（Bacillus）,解淀粉芽孢桿菌種（Bacillusamyloliquefaciens）。專利技術人提供的解淀粉芽孢桿菌HP60的篩選方法是：先從豆豉采樣，將樣品中的蛋白酶產生菌分別經富集培養后，采用酪蛋白為底物，經過富集培養后稀釋涂布在酪蛋白平板選擇培養基上，以微生物分解酪蛋白的能力作為初篩指標，挑取具有透明圈較大的菌落在酪蛋白平板上三區劃線純化，純化后的單菌落移接斜面培養基保存，從而實現初篩；之后以米渣為底物，搖瓶發酵復篩，以微生物搖瓶發酵米渣，離心，上清液注酪蛋白平板孔，恒溫培養，以平板孔直徑為指標第一次復篩；平板經直徑較大的菌株再經搖瓶發酵米渣，離心后測上清液蛋白酶活力，以酶活為指標二次復篩；最后酶活較高的菌株發酵米渣，離心，上清液沸水滅酶，測上清液中氨態氮，以氨態氮為指標第三次復篩。所述富集培養的條件為：富集培養基以g/100mL計的成分：牛肉膏0.5～1.0，蛋白胨0.5～1.0，(NH4)2SO40.1～0.2，K2HPO40.5～1.0，MgSO4·7H2O0.01～0.02，CaCl20.01～0.02，NaCl0.5～1.0，其pH6.5～7.5；酪蛋白選擇培養基以g/100mL計的成分：牛肉膏0.5～1.0，酪蛋白0.5～1.0，(NH4)2SO40.1～0.2，K2HPO40.5～1.0，MgSO4·7H2O0.01～0.02，CaCl20.01～0.02，NaCl0.5～1.0，瓊脂粉2.0，其pH6.5～7.5；斜面保藏培養基細菌為細菌完全培養基，真菌為PDA培養基；種子培養基同發酵培養基以g/100mL計的成分：米渣1.2～1.8，NaCl0.5～1.0，MgSO4·7H2O0.01～0.02，CaCl20.01～0.02，K2HPO40.5～1.0，其pH6.5～7.5。為了驗證本專利技術的菌株，專利技術人進行了如下實驗：⑴樣品采集：23個分離樣品分別采集于2012年10月，從貴州花溪傳統臘肉、豆豉、酸肉、發酵肉、豆制品、酒曲、酒醅采樣，用聚乙烯袋封口；2012年11月從貴州黔東南屠宰場及花溪貴州大學南區食堂附近的表層土壤、淤泥采樣，用聚乙烯袋封口；取回樣品后，即著手分離工作。⑵富集培養：稱取5.0g樣品，加入到50mL無菌生理鹽水中，再放入4顆小玻璃珠，于30℃、180r/min下振蕩培養30min，取5mL加入富集培養基中，30℃、180r/min下搖床富集培養24h；上述富集培養基的成分為（以g/100mL計）：牛肉膏0.5～1.0，蛋白胨0.5～1.0，(NH4)2SO40.1～0.2，K2HPO40.5～1.0，MgSO4·7H2O0.01～0.02，CaCl20.01～0.02，NaCl0.5～1.0，其pH6.5～7.5。⑶初篩：取上述0.2mL稀釋適當梯度的富集菌液涂布于酪蛋白選擇培養基平板，靜置5min，倒置平板，于30℃培養。挑取形成透明圈較大的單一菌落，劃線純化后在試管斜面上劃Z形線，30℃條件下培養至出現豐滿的菌落后，4℃冰箱保藏。初篩共獲得形成明顯透明圈的菌株115株，其中菌株HP60形成的透明圈較大。上述初篩酪蛋白選擇培養基的成分為（以g/100mL計）：牛肉膏0.5～1.0，酪蛋白0.5～1.0，(NH4)2SO40.1～0.2，K2HPO40.5～1.0，MgSO4·7H2O0.01～0.02，CaCl20.01～0.02，NaCl0.5～1.0，瓊脂粉2.0，其pH6.5～7.5。斜面保藏培養基：細菌用細菌完全培養基，真菌用PDA培養基。⑷第一次復篩：用打孔器在初篩酪蛋白選擇培養基平板上打孔，每平板均勻打3孔（三孔為一組平行），孔徑為0.4cm。挑取初篩試管菌2環接入種子培養基中，以30℃、180r/min培養24h后，以6％～8％（1.235×106cfu/mL）接種量接入發酵培養基中，在同樣條件下培養24h后，于4℃、10000r/min離心1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株水解米渣的蛋白酶產生菌——解淀粉芽孢桿菌，其特征在于該解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)菌株純培養物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60，保藏單位地址：中國武漢·武漢大學430072，保藏編號為CCTCC?NO.M?2014200。

【技術特征摘要】
1.一株水解米渣的蛋白酶產生菌——解淀粉芽孢桿菌，其特征在于該解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株純培養物已于2014年5月13日保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，簡稱解淀粉芽孢桿菌HP60，保藏編號為CCTCCNO.M2014200。2.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于所述解淀粉芽孢桿菌HP60的形態特征和生理生化特征接近芽孢桿菌屬，其16SrRNA序列與Genbank中已知Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumstr.FZB42NC009725.1序列同源性在99％以上，看家基因recA與BacillusamyloliquefaciensIT-45、BacillusamyloliquefaciensLFB112同源性達99％；根據≤伯杰氏系統細菌學手冊≥...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何臘平，薛榮濤，李翠芹，
申請(專利權)人：貴州大學，
類型：發明
國別省市：貴州;52