本發明專利技術發現了一種去氧鬼臼毒素作為辣椒素受體拮抗劑的用途，包括以下步驟：(1)建立及培養穩定轉染辣椒素受體的CHO?VR1細胞株。(2)激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的EC80。(3)拮抗劑模型建立及陽性藥驗證，確定拮抗劑的IC50。(4)采用穩轉細胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行辣椒素受體拮抗劑的活性篩選，得到有明顯量效關系的化合物。本發明專利技術的優點主要有：1)通過測定得到的化學發光值判斷化合物對受體的拮抗作用強弱；2)化學發光檢測值靈敏度高，提高檢測結果精確度；3)分析結果穩定可靠，重現性好。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種去氧鬼臼毒素辣椒素受體拮抗劑的鎮痛用途。?
技術介紹
去氧鬼臼毒素是從中藥桃兒七Sinopodophyllum?emodi(Wall.)中提取純化而得的化合物，研究表明其具有明確的對腫瘤細胞體外抗增殖作用(Planta?Medica，1993，59(3)：246-249.)、環氧酶、脂氧酶抑制作用(Biol.Pharm.Bull，2004，27(6)：786-788.)和小鼠醋酸扭體鎮痛作用(Pharm?Biol.2013；51(5)：566-72.)。?辣椒素(VR1)受體是一種由838個氨基酸組成的非選擇性陽離子通道，共有6個錨蛋白重復序列(ARD)，第5“指環”為一孔道形成部位，N端、C端均位于細胞質內。VR1受體具有脂質結合部位和質子化、磷酸化位點，可被G蛋白耦聯受體和酪氨酸激酶受體間接激活。是研究最為廣泛、最受關注的非選擇性陽離子通道受體之一。VR1廣泛分布于哺乳動物的感覺神經纖維，尤其是無髓鞘的C類和部分少髓鞘的Aδ類纖維。所以，有以上神經纖維支配的組織幾乎都有VR1分布。?疼痛是一種復雜的生理心理活動，是臨床上最常見的癥狀之一。疼痛感覺在生理狀態下起保護作用，預警有傷害來臨，提示肌體規避傷害；但在病理狀態下，疼痛是多數疾病的主要癥狀之一，而慢性疼痛本身就是一種疾病。引起疼痛感覺的傷害性感受(nociception)首先是通過皮膚或內臟黏膜內的傷害性感受器(nociceptor)感知，以電信號的方式通過傳遞痛覺的傳入神經纖維(主要是無髓鞘的C類纖維和部分少髓鞘Aδ類纖維)傳遞給初級感覺神經元(脊髓背根神經節和三叉神經節)，由此類神經元整合后進一步傳遞給脊髓的二級神經元，再沿脊髓逐步上傳，最終進入大腦皮層(皮層感覺中樞)才形成有意識的痛覺。無論是位于皮膚內的傷害性感受器、以及傳遞傷害性感覺的傳入神經纖維，還是向脊髓傳遞的輸入性纖維都是由初級感覺神經元生成，所以初級感覺神經元在痛覺產生及傳導過程中都起到了極為關鍵的作用。而在以上傳遞途徑中都有VR1表達，VR1作為一類與痛覺傳遞有密切聯系的膜上離子通道型受體，在介導炎性痛、內臟痛和癌痛甚至痛覺敏化等多種疼痛中起重要作用。?目前研究認為VR1是感知疼痛的關鍵分子之一。大多數研究表明辣椒素受體拮抗劑無論是在臨床前還是臨床研究階段都表現出顯著的鎮痛作用，VR1一直是被賦予了高期望值的、研發鎮痛藥的靶點之一。MK-2295(NGD-8243)和GRC6211分別是由美國Merck-Neurogen公司和印度Glenmark公司研發的用于治療牙痛的小分子藥物，已經進入III期臨床試驗研究階段。由于是局部用藥，對體溫的影響較小，還是有很好的市場前景。AMG8562是由美國?Amgen公司研發的第二代VR1小分子拮抗劑，研究報告稱未發現對體溫有影響，ABT-102臨床前研究可顯著抑制實驗動物的炎性痛骨關節炎疼痛、手術后疼痛和骨癌疼痛，I期臨床試驗發現其安全性好。?
技術實現思路
本專利技術在采用辣椒素受體拮抗劑高通量篩選模型，通過功能性驗證尋找先導化合物，發現了一種去氧鬼臼毒素辣椒素受體拮抗劑，為新型的鎮痛藥開發提供先導化合物。本專利技術可為此類臨床外周傷害性疼痛治療藥物的開發提供先導化合物，為新型鎮痛藥物開發提供線索和實驗依據。?本專利技術的技術方案為：在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)內穩定轉染辣椒素受體，建立辣椒素受體拮抗劑靶向激動劑高通量篩選模型，初篩，復篩，構效關系分析，得到一類具有鎮痛作用的候選藥物。具體步驟如下：?步驟一：建立及培養穩定轉染辣椒素受體的CHO細胞株。?步驟二：激動劑篩選模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的EC80。?步驟三：拮抗劑篩選模型建立及陽性性藥驗證。?步驟四：采用穩轉細胞株和實驗確定的最佳檢測條件對化合物進行辣椒素受體拮抗劑的活性篩選，得到有明顯量效關系的化合物。?本專利技術在研究去氧鬼臼毒素的體外活性過程中，發現其具有對辣椒素受體有顯著的抑制作用，可以作為先導化合物進行臨床用途的開發。?附圖說明：圖1：激動劑量效曲線?圖2：拮抗劑量效曲線?圖3：去氧鬼臼毒素量效曲線?具體實施方式去氧鬼臼毒素對辣椒素受體的拮抗作用研究。?1.建立及培養穩定轉染辣椒素受體的CHO?VR1細胞株。?2.激動劑模型建立及陽性藥驗證，確定激動劑的EC80：將細胞于無抗生素的培養基中培養18h后用PBS+0.5mM?EDTA將細胞消化下來，離心機離心后，將3x105cells/mL細胞于分析緩沖液中重懸。在無菌條件下，向以上的細胞懸液中加入腔腸素，使之終濃度達到5μM，混合均勻。在室溫下避光孵育4小時，并不斷攪動。將上述細胞懸液中加入5倍細胞懸液的緩沖液中稀釋，并在以上條件下培養1小時，并不斷攪動。在稀釋緩沖液中準備各種梯度配體激動劑?稀釋液。?3.在384孔板中每孔加入20μl的激動劑稀釋液。將地高辛、ATP、緩沖液加入空白對照孔中作為本實驗的內參照，使地高辛的終濃度達到100μM，ATP的終濃度為50μM。?4.利用Envision檢測儀的加樣裝備，在每孔中加入20μl的細胞懸液，即時檢測20s，15s，10s，5s，3s內鈣離子變化情況，儀器得出的最終結果表示為該檢測時間內引起鈣離子變化峰的峰面積。對實驗數據作圖，可得出最佳檢測時間為20s及激動劑的EC50和EC80。?5.拮抗劑模型建立及陽性藥驗證，確定拮抗劑的IC50：細胞處理同上所述，在384孔板中每孔加入10μl的細胞液以及10μl拮抗劑稀釋液，室溫孵育1小時。配制激動劑最大效應濃度(激動劑的EC80)，利用Envision將激動劑泵入反應完全的384孔板中，每孔20μl，即時檢測20s內鈣離子變化情況，儀器得出的最終結果表示為20s內引起鈣離子變化峰的峰面積。對實驗數據作圖，可得出拮抗劑的IC50。相關質控結果，辣椒素受體激動劑實驗結果見圖1，拮抗劑實驗結果見圖2.?6.采用摸索的最佳檢測條件在穩轉細胞中對辣椒素受體拮抗劑進行初篩與復篩。用Janus全自動加樣工作站將化合物從96孔化合物母液板轉移至96孔化合物子板第一排并對化合物逐級稀釋，并吸取10μl稀釋好的化合物轉移至384孔板中；Multidrop自動加樣儀將處理好的細胞液10μl加入384孔板中，孵育1小時；利用Envision將激動劑泵入反應完全的384孔板中，每孔20ul，即時檢測20s內鈣離子變化情況。處理數據，計算所篩選化合物IC50。對篩選出的有效的化合物進行構效關系分析，先導化合物實驗結果見圖3。?辣椒素受體活性篩選實驗結果?篩選得到的辣椒素受體抑制劑去氧鬼臼毒素其結構與IC50如下：?IC50：4.62×10-6μM。?本文檔來自技高網...
【技術保護點】
要求保護的式I的化合物或其藥學上可以接受的鹽用于制備辣椒素受體抑制劑的用途。
【技術特征摘要】
1.要求保護的式I的化合物或其藥學上可以接受的鹽...
【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴明，胡潔，高鵬，張陸勇，吳葆金，
申請(專利權)人：中國藥科大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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