本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標記的AAL、用于形成GP73抗體-抗原-生物素標記AAL復合物并進行ELISA檢測的AAL-ELISA檢測板和用于形成GP73抗體-抗原-生物素標抗體復合物并進行ELISA檢測的Protein-ELISA檢測板。本發(fā)明專利技術(shù)所述的方法及試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測快速準確等突出優(yōu)點，對肝癌的診斷具有重要的臨床價值。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，與應(yīng)用性基礎(chǔ)醫(yī)學研究和臨床研究相聯(lián)系；涵蓋腫瘤學、診斷學，糖生物學。
技術(shù)介紹
肝細胞性肝癌(HCC)是一種多基因、多因素、病理機制復雜的常見惡性腫瘤。在我國，乙肝病毒攜帶者占人口的7.18％，是全世界乙肝攜帶者的2/3，肝病發(fā)病率仍居全球之首，全球50％以上的年新增肝癌病例發(fā)生在我國。絕大多數(shù)患者發(fā)病隱匿，出現(xiàn)臨床癥狀后就醫(yī)時已屬晚期，喪失了治療的良機，因此早期診斷對于提高患者的生存率至關(guān)重要。理想的肝癌標志物需要有較高的特異性，能夠?qū)⒏伟┡c肝硬化、肝炎、肝臟再生結(jié)節(jié)等疾病區(qū)分開來；同時還需較高的敏感性，能夠在肝癌早期即提示診斷，同時應(yīng)具有易檢測、可重復、可經(jīng)非侵入性操作測定等特點。在蛋白質(zhì)不同的翻譯后修飾中，糖基化最為常見，幾乎50％的蛋白質(zhì)都被認為具有糖基化修飾。糖蛋白聚糖存在著宏觀和微觀的不均一性，其結(jié)構(gòu)功能變化和與疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。聚糖在很多關(guān)鍵的生物學過程中起到重要作用，比如細胞黏附、分子運輸和清除、受體激活、信號轉(zhuǎn)導以及內(nèi)吞作用等。在生物體發(fā)育過程中，聚糖結(jié)構(gòu)也在變化，在不同的分化階段，聚糖有不同的表達。在癌癥的發(fā)生過程中，糖基化的改變是普遍存在的，如能關(guān)注糖基化的變化，可以提升診斷的特異性和敏感性。因此，利用檢測糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)的異常來診斷惡性腫瘤已引起相當重視，如AFP-L3的變化已成為檢測肝癌的重要聚糖標志等。目前檢測糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)方法有生物質(zhì)譜、液相色譜和植物凝集素親和印跡等，其中植物凝集素是一類存在于多數(shù)植物中的糖蛋白，其最大特點是能夠識別糖蛋白和糖脂中的聚糖，特別是細胞膜中復雜結(jié)構(gòu)的聚糖即細胞膜表面決定簇，它們與聚糖的結(jié)合是非共價且可逆的。AAL(楊樹茹凝集素)是一種親和α連接巖藻糖(TerminalαFuc和±Sia-Lex)的植物凝集素，巖藻糖修飾能賦予聚糖很多獨特的功能特性，其在輸血反應(yīng)、凝集素介導的白細胞和內(nèi)皮的粘附、宿主和微生物相互作用和個體發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。此外，巖藻糖還參與構(gòu)成某些重要粘附分子的聚糖結(jié)構(gòu)，與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在癌癥中發(fā)現(xiàn)sialyl?Lewisx和sialyl?Lewisa含量增多，許多腫瘤中A和B型血型抗原丟失伴隨著H血型抗原和Lewisy表達升高。高爾基體蛋白73(GP73)是一種高爾基體II型膜蛋白，表達于上皮細胞，是一種糖蛋白，包含3個潛在N-糖基化位點：Asn109，Asn144和Asn398。隨著糖生物學技術(shù)的發(fā)展，已有研究證實將GP73的巖藻糖基化異質(zhì)體在某些肝癌患者中作為標志物進行檢測會優(yōu)于GP73。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)相比于肝硬化患者，肝癌患者血清單位GP73親和AAL能力顯著降低，說明肝癌患者的單位GP73巖藻糖基化聚糖含量降低。本專利技術(shù)應(yīng)用AAL對巖藻糖化聚糖的高親和性，通過AAL-ELISA和Protein-ELISA的制備與檢測，分別形成GP73抗體-抗原-生物素標AAL復合物和GP73抗體-抗原-生物素標抗體復合物，獲得GP73結(jié)合AAL的吸光度與GP73蛋白的吸光度比值Fuc-GP73，通過對臨床資料進行回顧性研究，建立腫瘤判別診斷函數(shù)，獲得ROC曲線和Cut?off值，同時比較AFP-L3和Fuc-GP73對肝癌診斷的準確率差異。本專利技術(shù)適用于肝癌高發(fā)現(xiàn)場或者肝病人群大規(guī)模篩查，對于提高肝癌的診斷率，實現(xiàn)早期干預(yù)治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種具有較高準確率的用于診斷肝細胞性肝癌(HCC)的試劑盒。為了達到上述目的，本專利技術(shù)提供了一種用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標記的AAL、用于形成GP73抗體-抗原-生物素標記AAL復合物并進行ELISA檢測的AAL-ELISA檢測板和用于形成GP73抗體-抗原-生物素標抗體復合物并進行ELISA檢測的Protein-ELISA檢測板。優(yōu)選地，所述的AAL-ELISA檢測板的預(yù)處理方法為：在AAL-ELISA檢測板中加入GP73捕獲抗體，AAL-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為1μg/mL，用量為100μL/well，室溫孵育過夜；采用PBST緩沖液洗板；采用含有3％BSA(質(zhì)量-體積濃度)的PBS溶液進行封閉，用量為200μL/well采用PBST緩沖液洗板；采用pH?4.0的含有100mM?NaIO4和50mM檸檬酸的溶液進行氧化，用量為200μL/well，4℃避光反應(yīng)1h；采用PBST緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的AAL-ELISA檢測板。優(yōu)選地，所述的Protein-ELISA檢測板的預(yù)處理方法為：在Protein-ELISA檢測板中加入GP73捕獲抗體，Protein-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為2μg/mL，用量為100μL/well，室溫孵育過夜；采用PBST緩沖液洗板；采用含有1％BSA(質(zhì)量-體積濃度)和0.05％NaN3(質(zhì)量-體積濃度)的PBS溶液進行封閉，用量為200μL/well；采用PBST緩沖液洗板；采用含有1％BSA(質(zhì)量-體積濃度)和0.05％NaN3(質(zhì)量-體積濃度)的PBS溶液進行氧化，用量為200μL/well，4℃避光反應(yīng)1h；采用PBST緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的Protein-ELISA檢測板。優(yōu)選地，所述的GP73捕獲抗體溶液共有兩種，濃度分別為1μg/mL和2μg/mL。優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括生物素標記的GP73抗體。優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包含含有3％BSA的PBS溶液，含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液，pH?4.0的含有100mMNaIO4和50mM檸檬酸的溶液。優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括PBST緩沖液。優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)。優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括底物溶液和終止液。優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包含采集血樣裝置及操作說明書。本專利技術(shù)中提及的GP73蛋白由前期糖蛋白質(zhì)組學工作確定單位GP73親和AAL能力顯著降低，說明肝癌患者的單位GP73巖藻糖基化聚糖含量減少。本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標記的AAL、用于形成GP73抗體?抗原?生物素標記AAL復合物并進行ELISA檢測的AAL?ELISA檢測板和用于形成GP73抗體?抗原?生物素標抗體復合物并進行ELISA檢測的Protein?ELISA檢測板。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在
于，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標記的AAL、用于形成GP73抗體-抗原-
生物素標記AAL復合物并進行ELISA檢測的AAL-ELISA檢測板和用于形成
GP73抗體-抗原-生物素標抗體復合物并進行ELISA檢測的Protein-ELISA檢測
板。
2.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑
盒，其特征在于，所述的AAL-ELISA檢測板的預(yù)處理方法為：在AAL-ELISA
檢測板中加入GP73捕獲抗體，AAL-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為1μg/mL，
用量為100μL/well，室溫孵育過夜；采用PBST緩沖液洗板；采用含有3％BSA
的PBS溶液進行封閉，用量為200μL/well；采用PBST緩沖液洗板；采用pH?4.0
的含有100mM?NaIO4和50mM檸檬酸的溶液進行氧化，用量為200μL/well，4
℃避光反應(yīng)1h；采用PBST緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的AAL-ELISA檢測板。
3.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學預(yù)測的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑
盒，其特征在于，所述的Protein-ELISA檢測板的預(yù)處理方法為：在Protein-ELISA
檢測板中加入GP73捕獲抗體，Protein-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為2μg/mL，
用量為100μL/well，室溫孵育過夜；采用PBST緩沖液洗板；采用含有1％BSA
和0.05％NaN3的PBS溶液進行封閉，用量為200μL/well；采用PBST緩沖液洗
板；采用含有1％BSA和0.05％NaN3的PBS溶液進行氧化，用量為200μL/well，
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張舒，郭坤，劉銀坤，
申請(專利權(quán))人：復旦大學附屬中山醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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