用于合成色胺和色胺類似物的衍生物的生物催化劑和方法技術

本公開內容提供了用于產生胺的工程化轉氨酶多肽、編碼該工程化轉氨酶的多核苷酸、能夠表達該工程化轉氨酶的宿主細胞、以及使用該工程化轉氨酶制備在產生活性藥物試劑中有用的化合物的方法。本公開內容提供了具有轉氨酶活性的工程化多肽、編碼該多肽的多核苷酸、制備該多肽的方法、和使用該多肽用于將酮底物生物催化轉化為胺產物的方法。本發明專利技術的酶已被工程化為具有與河流弧菌(Vibrio?fluvialis)的天然存在的轉氨酶的氨基酸序列相比的一個或更多個殘基差異。特別是，本公開內容的轉氨酶已被工程化為從其相應的前手性酮底物有效形成手性色胺衍生物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于合成色胺和色胺類似物的衍生物的生物催化劑和方法1.
本公開內容涉及轉氨酶生物催化劑以及使用該生物催化劑制備色胺和色胺類似物的衍生物的方法。2.對序列表、表格或計算機程序的引用序列表的正式文本作為ASCII格式文本文件與說明書經EFS-Web同時被提交，文件名為“CX2-105USP1_ST25.txt”，創建日期為2012年3月23日，且大小為457,542千字節。經EFS-Web提交的序列表為本說明書的一部分，并且通過引用以其整體并入本文。3.背景色胺類化合物具有核心通式色胺和色胺類似物的衍生物，諸如同質色胺(homotryptamine)，可對胺上的α-碳、β-碳和吲哚環進行取代。因為此類衍生物與神經遞質血清素和褪黑激素在結構上相似，許多具有精神活性屬性。例如，5-羥基-N,N-二甲基色胺、N,N-二甲基色胺、4-羥基-N,N-二甲基色胺、5-甲氧基-α-甲基色胺、α-甲基色胺、和α-乙基色胺具有致幻性質并在美國被規定為列表1管制物質(Schedule1ControlledSubstances)。色胺、色胺類似物及其衍生物還形成了許多藥物化合物的骨架，例如致幻劑麥角酰二乙胺(LSD)、抗瘧原蟲藥螺吲哚酮(Yeung等人，2010,JMedChem.53:5155–5164)，痛覺螺環己烷衍生物(美國專利公布號20100240897)，以及法尼酯X受體拮抗劑氮雜卓并吲哚(azepinoindole)衍生物(美國專利公布號20100173824)。在α-碳處具有取代基的色胺衍生物，例如α-甲基色胺、或以及α-乙基色胺，導致手性中心，并且這些對映體已顯示了展示不同的生物活性。例如，α-甲基色胺的S-異構體顯示比R-異構體更大的效力(參見，例如，D.B.Repke等人，1976,JHeterocyclChem.13:775)。具有手性α-甲基色胺或α-甲基同質色胺組分的抗瘧原蟲藥螺吲哚酮的不同異構體，也顯示不同的效力，例如(1R,3S)異構體顯示比(1R,3R)異構體更高的抗瘧原蟲活性(參見上述Yeung；WO2009/132921)：制備手性α-碳取代的色胺和色胺類似物，諸如α-甲基色胺和α-甲基同質色胺，可采用分離/隔離期望的異構體或使用采用手性起始化合物用于不對稱合成的化學合成途徑。后者的示例是合成抗瘧原蟲藥螺吲哚酮，其可使用D-色氨醇作為起始化合物用于合成手性中間體S-α-甲基色胺(上述Yeung等人)。用于制備手性化合物的其他一般方法包括與保留手性的無手性試劑連續反應，使用摻入了對映體純的手性中心的試劑或催化劑以轉換對映體為具有不同反應性的非對映體，使用化學手性催化劑以及手性助劑化合物。分離并隔離對映體可以是費時的，而化學不對稱合成策略可受限于分子可經歷的可能反應，需要苛刻的反應條件和/或復雜的合成路線。實例是D-色氨醇在合成螺吲哚酮中的可用性，其由于其合成需要的復雜的合成步驟而受限。因此，期望開發用于制備α-取代的色胺及結構上相關的類似物的合成方法，該方法使用溫和條件，導致期望的手性化合物的高對映體過量，具有起始原料至期望的產物的高轉化，并且是成本有效的。4.概述本公開內容提供了具有轉氨酶活性的工程化多肽、編碼該多肽的多核苷酸、制備該多肽的方法、以及使用該多肽用于生物催化轉化酮底物為胺產物的方法。與河流弧菌(Vibriofluvialis)的天然存在的轉氨酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和具有增強的溶劑穩定性和熱穩定性的參考工程化轉氨酶的氨基酸序列(SEQIDNO:4)相比，本專利技術的酶已被工程化為具有一個或更多個殘基差異，其中殘基差異存在于影響以下各種酶特性的殘基位置上：包括活性、立體選擇性、穩定性、表達、和產物耐受性，以及其他。特別地，本公開內容的轉氨酶已被工程化為從其相應的前手性酮底物有效形成手性色胺衍生物。因此，本文公開的工程化多肽展示了在從相應的前手性酮底物形成色胺衍生物中，特別是在底物化合物(2)，1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-酮向產物化合物(1)，(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺的轉化中，增加的活性、溶劑穩定性和熱穩定性、增加的產物耐受性、以及高立體選擇性，以及其他，因此，在一個方面，本公開內容提供了具有轉氨酶活性的工程化多肽，其中該工程化多肽包括具有與SEQIDNO:2或4的至少80％同一性和與SEQIDNO:4相比在選自以下的殘基位置上的一個或更多個殘基差異的氨基酸序列：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中在殘基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417處的殘基差異選自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。在一些實施方案中，在殘基位置X14；X26；X33；X41；X47；X70；X88；X107；X132；X148；X173；X203；X250；X284；X315；X346；X395；X400；X419；X423；X448；和X451處的殘基差異選自X14V；X26R；X33T；X41L；X47N；X70A；X88A；X88L；X107P；X132F；X148Q；X148R；X173A；X203S；X250A；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S；X423I；X448E；和X451D。如本文所提供，在一些實施方案中，公開的殘基差異可單獨或以各種組合被用于產生具有改進的酶特性的工程化多肽。在本文詳細的說明書中提供了關于殘基差異的選擇和對酶特性的影響的指導。在一些實施方案中，工程化轉氨酶多肽包括具有與參考序列SEQIDNO:4的至少80％序列同一性和與SEQIDNO:4相比在選自以下的殘基位置上至少一個殘基差異的氨基酸序列：X14、X86、X163、或X400。在一些實施方案中，氨基酸序列具有在位置X163上的至少一個殘基差異，其中氨基酸殘基選自I、L、R和V。在一些實施方案中，工程化轉氨酶多肽包括具有與SEQIDNO:4相比選自以下的殘基差異的組合的氨基酸序列：(a)X14V和X163I/L/R/V；(b)X86D和X400G；(c)X57F/Y和X163I/L/R/V；(d)X57F/Y和X398L/V/W；(e)X14V、X113L/V、X163I/L/R/V、X284A、和X424V；以及(f)X31S、X57F/Y、X163I/L/R/V、X315G、X346L、和X398L/V/W。在一些實施方案中，工程化轉氨酶多肽包括具有與SEQIDNO:4相比選自以下的殘基差異的組合的氨基酸序列：(a)X14V、X113L、X163L、X284A、和X424V；(b)X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G；(c)X14V、X2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有轉氨酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽包括具有與SEQ?ID?NO:4的至少80％同一性和與SEQ?ID?NO:4相比在選自以下的殘基位置上的一個或更多個殘基差異的氨基酸序列：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中在殘基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417上的殘基差異選自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.03.23 US 61/614,6661.一種具有轉氨酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽的序列基于SEQIDNO:4并且與SEQIDNO:4相比，所述工程化多肽中的殘基差異是X163L/I/V，任選地與選自以下的一個或更多個殘基差異組合：X14V、X26R、X31S、X33T、X41L、X57F/Y、X86Y、X88L/A、X107P、X113L/V、X132F、X148Q、X168S/K、X173A、X203S、X284A、X314N、X315G、X324H、X346L、X383A、X395P、X398V/W/L、X400G、X417M、X419S、X420N、X423I、X424V、X448E和X451D。2.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的殘基差異是X163L/I/V與選自以下的一個或更多個殘基差異的組合：X14V；X26R；X33T；X41L；X88A；X88L；X107P；X132F；X148Q；X173A；X203S；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S；X423I；X448E；和X451D。3.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的殘基差異是X163L/I/V與選自X14V；X26R；X33T；X41L；X88A；X88L；X107P；X132F；X148Q；X173A；X203S；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S；X423I；X448E；和X451D的一個或更多個殘基差異以及選自X57F；X113L；X113V；X168K；X420N；和X424V的一個或更多個殘基差異的組合。4.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的殘基差異是X163I/L/V與選自以下的至少一個或更多個殘基差異的組合：X14V；X26R；X31S；X284A；X315G；X398L/V/W；和X400G。5.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的殘基差異是選自以下的殘基差異組合：X14V和X163I/L/V；X57F/Y和X163I/L/V；X14V、X113L/V、X163I/L/V、X284A、和X424V；X31S、X57F/Y、X163I/L/V、X315G、X346L、和X398L/V/W；X14V、X113L、X163L、X284A、和X424V；X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G；X57F、X163L、X168K、X314N、X315G、X346L、和X398V；X14V、X163L、X173A、X400G、和X420N；X14V、X113L、X163L、和X284A；X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G；以及X14V、X33T、X57F、X113L、和X163L。6.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽具有與SEQIDNO:4的多肽相比至少1.2倍增加的穩定性，其中所述工程化多肽中的殘基差異是X163I/L/V與選自以下的一個或更多個的組合：X14V；X26R；X31S；X33T；X41L；X88A/L；X284A；X324H；X419S；和X423I。7.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽的序列選自：SEQIDNO:6、8、14、16、22、24、28、30、32、48、52、56、62、64、86、88、90、92、98、100、104、106、108、110、112、114、116、118、120、124、126、128、132、134、136、142、144、148和154。8.如權利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽固定在固體支持物上。9.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求1所述的工程化多肽。10.一種表達載體，所述表達載體包含權利要求9所述的多核苷酸。11.如權利要求10所述的表達載體，所述表達載體還包含控制序列。12.一種宿主細胞，所述宿主細胞包括權利要求9所述的多核苷酸或權利要求10或11所述的表達載體。13.一種制備工程化多肽的方法，所述方法包括在適合于表達所述工程化多肽的條件下培養權利要求12所述的宿主細胞。14.如權利要求13所述的方法，所述方法還包括分離所述工程化多肽。15.一種用于制備式(I)的化合物的方法，其中R1選自由以下組成的組：氫、羧基、羧基(C1-C6)烷基、任選地取代的(C1-C6)烷基、任選地取代的(C2-C6)烯基、任選地取代的烷氧基羰基、任選地取代的芳基羰基、任選地取代的芳基磺酰基、和保護基團；R2選自由以下組成的組：氫、氧代、鹵代、羥基、氨基、硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)二烷基氨基、(C1-C6)烷基硫代、(C1-C6)烷基磺酰基、(C1-C6)烷基亞磺?；?、和任選地取代的(C1-C6)烷氧基；R4、R6和R7各自彼此獨立地選自由以下組成的組：氫、鹵代、羥基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C6)烷基、任選地取代的(C1-C6)烷氧基、任選地取代的(C1-C6)烷基氨基、任選地取代的(C1-C6)二烷基氨基、任選地取代的(C1-C6)烷基硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基磺酰基、任選地取代的(C1-C6)烷基亞磺?；?、羧基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷基羰基氧基、任選地取代的氨基羰基、氨基羰基(C1-C6)烷基、任選地取代的環烷基、任選地取代的雜環烷基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、任選地取代的芳氧基、任選地取代的芳基氨基、任選地取代的芳基硫代、任選地取代的芳基磺?；⑷芜x地取代的芳基亞磺?；?、任選地取代的芳基氧基羰基、任選地取代的芳基羰基氧基、任選地取代的雜芳基氧基、任選地取代的雜芳基氨基、任選地取代的雜芳基硫代、任選地取代的雜芳基磺酰基、任選地取代的雜芳基亞磺酰基、任選地取代的雜芳基氧基羰基、任選地取代的雜芳基羰基氧基、烷基氨基磺?；?C1-C6)烷基、芳基磺酰基(C1-C6)烷基、和雜芳基磺酰基(C1-C6)烷基；R5選自由以下組成的組：氫、鹵代、羥基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C6)烷基、任選地取代的(C1-C6)烷氧基、任選地取代的(C1-C6)烷基氨基、任選地取代的(C1-C6)二烷基氨基、任選地取代的(C1-C6)烷基硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基磺酰基、任選地取代的(C1-C6)烷基亞磺?；Ⅳ然?C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷基羰基氧基、任選地取代的氨基羰基、氨基羰基(C1-C6)烷基、任選地取代的環烷基、任選地取代的雜環烷基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜芳基、任選地取代的芳氧基、任選地取代的芳基氨基、任選地取代的芳基硫代、任選地取代的芳基磺?；⑷芜x地取代的芳基亞磺酰基、任選地取代的芳基氧基羰基、任選地取代的芳基羰基氧基、任選地取代的雜芳基氧基、任選地取代的雜芳基氨基、任選地取代的雜芳基硫代、任選地取代的雜芳基磺?；⑷芜x地取代的雜芳基亞磺酰基、任選地取代的雜芳基氧基羰基、任選地取代的雜芳基羰基氧基、烷基氨基磺?；?C1-C6)烷基、芳基磺?；?C1-C6)烷基、和雜芳基磺?；?C1-C6)烷基、或與R4一起形成5至8元任選地取代的環烷基或任選地取代的雜環；R8選自由以下組成的組：任選地取代的(C1-C6)烷基、任選地取代的(C1-C6)烷氧基、任選地取代的環烷基、任選地取代的雜環烷基、任選地取代的芳基、和任選地取代的雜芳基、或與R2一起形成任選地取代的5至8元環烷基或雜環；以及n是1或2；條件是(a)當R2是氫時，則以下的至少一個適用：(i)R1不是氫、甲基、4-(甲氧基)苯基羰基-、4-(三氟甲氧基)苯磺?；?、3-溴苯基羰基-、3-氨基丙基、或3-(甲基羰基氨基)丙基-；(ii)R4和R7各自彼此獨立地不是氫或氯；(iii)R5不是氫、羥基、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、或氰基；(iv)R6不是氫、羥基、甲氧基、氟或氯；或(v)R8不是甲基、乙基、羥甲基、或三氟甲基-；以及(b)當n是1，R2和R8一起形成環己基環，并且R1、R4、R6、和R7是氫時，則R5不是氟；所述方法包括在適當的反應條件下在氨基供體的存在下，使式(II)的底物化合物與權利要求1至8的任一項所述的工程化多肽接觸，其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和n如以上所定義。16.如權利要求15所述的方法，其中式(I)的化合物包括在以*標記的碳原子上具有指定的立體化學的式(IS)的化合物，其中化合物(IS)以對映體過量來形成。17.一種用于制備式(Ia)的化合物的方法，其中，R1選自由以下組成的組：氫、羧基、羧基(C1-C6)烷基、任選地取代的(C1-C6)烷基、任選地取代的(C2-C6)烯基、任選地取代的烷氧基羰基、任選地取代的芳基羰基、任選地取代的芳基磺?；?、和保護基團；R2選自由以下組成的組：氫、氧代、鹵代、羥基、氨基、硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)二烷基氨基、(C1-C6)烷基硫代、(C1-C6)烷基磺?；?、(C1-C6)烷基亞磺酰基、和任選地取代的(C1-C6)烷氧基；R4、R5、R6和R7各自彼此獨立地選自由以下組成的組：氫、鹵代、羥基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基、羥基(C1-C6)烷基、任選地取代的(C1-C6)烷氧基、任選地取代的(C1-C6)烷基氨基、任選地取代的(C1-C6)二烷基氨基、任選地取代的(C1-C6)烷基硫代、任選地取代的(C1-C6)烷基磺?；⑷芜x地取代的(C1-C6)烷基亞磺?；?、羧基(C1-C6)烷基、(C1-C6...

【專利技術屬性】
技術研發人員：約瓦娜·納佐爾，德里克·史密斯，邁克爾·A·克羅，宋士瑋，史蒂文·J·科利爾，
申請(專利權)人：科德克希思公司，
類型：發明
國別省市：美國;US