一種脫細胞角膜組織及其制備方法和應用技術

本發明專利技術涉及角膜基質替代物領域，公開了一種脫細胞角膜組織及其制備方法，該方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。本發明專利技術還提供了所述脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應用。本發明專利技術的方法最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，板層結構保留完整，提高了支架材料的生物相容性，并且在角膜基質不變性的前提下使得脫細胞角膜組織能夠長期濕態保存。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術涉及角膜基質替代物領域，公開了一種脫細胞角膜組織及其制備方法，該方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。本專利技術還提供了所述脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應用。本專利技術的方法最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，板層結構保留完整，提高了支架材料的生物相容性，并且在角膜基質不變性的前提下使得脫細胞角膜組織能夠長期濕態保存。【專利說明】一種脫細胞角膜組織及其制備方法和應用
本專利技術涉及角膜基質替代物領域，具體地，涉及一種脫細胞角膜組織及其制備方 法和應用。
技術介紹
角膜位于眼球最表面，直接與外界接觸，容易受到損傷（物理、化學）和感染，一旦 發生病變則會發生混濁而影響視力，甚至致盲。常見的角膜病變有角膜炎、角膜潰瘍、圓錐 角膜、角膜軟化癥和角膜變性等。據世界衛生組織（WHO)統計，目前全世界有角膜病盲患者 近5000萬人，我國有約400萬人。角膜病嚴重影響了患者們的正常生活、工作與學習，生活 上需要家人和社會的照顧，增加了家庭的經濟負擔，也加重了全社會的負擔。角膜移植是角 膜病盲患者恢復視力和復明的唯一希望，但由于我國角膜捐獻數量極其有限，全國每年能 進行的角膜移植手術目前僅有3000余例，致使絕大多數患者因得不到可用的供體角膜而 無法重見光明。 目前，國內外同類產品主要以羊膜、膠原及其他合成高分子材料用于角膜移植研 宄，但都存在不同的缺陷。羊膜相對較薄，僅適用于治療眼表淺度損傷。合成材料的透明性 和穩定性較差，在降解過程中降解產物可引起局部PH值下降，術區出現非特異性無菌性炎 癥反應率較高。膠原是組織工程常用的材料，但純膠原韌性差，易碎，降解過快，手術后一段 時間內就發生碎裂，無法達到復明的效果，因此目前仍停留在基礎研宄階段。相比而言，異 種角膜基質材料來源豐富，具有與正常角膜基質相似的組織結構，移植之后角膜基質的厚 度、屈光度不變。天然的角膜基質層存在著某些生長因子，可促進細胞的生長、繁殖和分化， 而且免疫原性低，神經可以長入，有利于角膜知覺的恢復。此外，由于異種移植供體來源的 動物，如豬，在生理上與人類具有高度相似性，故其組織或器官被認為是理想的供體之一， 以豬作為異種移植供體來源的研宄比較深入，豬的組織器官（如心臟瓣膜、胰島細胞、凝血 因子等）已用于人類疾病的治療，異體脫細胞真皮基質已被批準用于臨床。豬角膜基質含 有角膜細胞生長所必需的多種細胞外基質成分，具有良好的生物相容性，能夠成為有效的 角膜基質替代物。 異種移植供體來源的動物（如豬）的角膜基質組織中含有自身固有的細胞，需經 過脫細胞處理才能獲得無免疫原性或免疫原性較低的角膜基質替代物。現有的角膜基質 替代物主要通過將動物源性角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌 處理獲得，且酶消化一般采用含有胰酶的緩沖液進行處理。這樣的方法對制備得到的角膜 基質替代物的膠原板層結構破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較 低，并不能完全滿足臨床移植的要求，而且無法長期濕態保存。 因此，研發一種能夠完全脫除異種移植供體來源的動物（如豬）角膜基質中的細 胞成分，對膠原板層結構破壞極小，使所得角膜基質的板層結構保留完整且膠原纖維排列 整齊、孔隙均勻規則、透光率較高且在角膜基質不變性的前提下能夠長期濕態保存的角膜 基質替代物的制備方法，具有重要的現實意義和廣闊的應用前景。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有方法對制備得到的角膜基質替代物的膠原板層結 構破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，透光率較低，并不能完全滿足臨床移 植要求且無法長期濕態保存的缺陷，提供一種膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規則、板層結構 保留完整、透光率較高且在角膜基質不變性的前提下能夠長期濕態保存的脫細胞角膜組織 及其制備方法和應用。 因此，為了實現上述目的，第一方面，本專利技術提供了一種脫細胞角膜組織的制備方 法，所述方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、 反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖 液進行處理。 第二方面，本專利技術提供了所述方法制備得到的脫細胞角膜組織。 第三方面，本專利技術還提供了所述脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應 用。 本專利技術的脫細胞角膜組織，來源豐富，生物相容性及生物安全性好，膠原纖維排列 整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整，且在角膜基質不變性的 前提下能夠長期濕態保存；理化性能良好，角膜透光率為70% -80% ;機械強度高，能夠耐 受手術縫線牽拉、韌性良好并能長期應用于臨床，主要用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、 疤痕、化學或熱燒傷等致盲性眼病，將病變處被損壞的角膜切除并將同樣尺寸的板層角膜 基質支架植入患者眼中，能夠達到構建健康角膜組織、改善患者視力的效果。 本專利技術的方法具有以下特點： 1)本專利技術方法的工藝流程簡單可靠，周期短。 2)本專利技術方法采用的原料來源廣泛，成本低，使用方便。 3)本專利技術的方法，最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列 整齊，無細胞殘留，前彈力層及基底膜都保留，便于上皮層的生長，提高了脫細胞角膜組織 的生物相容性。 4)本專利技術方法制備得到的脫細胞角膜組織，在使用前用生理鹽水或PBS緩沖液清 洗后即可使用而無需進行復水處理，使用方便，且在角膜基質不變性的前提下能夠長期濕 態保存，可長達6個月。 5)本專利技術方法制備得到的脫細胞角膜組織，通過自檢、型式檢驗驗證了該產品的 安全性，結果顯示其機械性能、理化性能及生物學性能都滿足臨床移植的要求。 6)本專利技術方法制備得到的脫細胞角膜組織，適合用于基質層異常角膜的臨床移 植，使眾多角膜基質異常患者重見光明成為可能，為組織工程角膜產業提供了重要的技術 支持。 本專利技術的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。 【專利附圖】【附圖說明】 圖1是本專利技術實施例1制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。 圖2是正常人角膜板層結構的冰凍切片圖。 圖3是本專利技術實施例5制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。 圖4是本專利技術實施例6制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。 圖5是本專利技術對比例1制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。 圖6是本專利技術對比例2制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。 【具體實施方式】 以下對本專利技術的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。 第一方面，本專利技術提供了一種脫細胞角膜組織的制備方法，所述方法包括：將在無 菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、 滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。 根據本專利技術的方法，本領域技術人員可以理解的是，在無本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種脫細胞角膜組織的制備方法，其特征在于，所述方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王寶泉，李青，
申請(專利權)人：青島中皓生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37