一種快速診斷桑椹縮小型菌核病的方法技術

一種快速診斷桑椹縮小型菌核病的方法，通過發現的病原核地杖菌特異性保守DNA序列，獲得了特異性SCAR-PCR引物，建立了桑椹縮小型菌核病SCAR-PCR診斷檢測方法。該方法的靈敏度高(檢測靈敏度為1?pg/μL)，特異性強，使用方便快捷，檢測結果準確可靠，可用于桑椹縮小型菌核病的田間診斷和桑果帶菌情況檢測檢驗；同時還可用于病害潛伏期(已侵染桑果但未顯癥的時期)診斷，從而對病害做出早期預報，以及時實施必要的控制措施，安全有效地防治病害的發生和危害，減輕或避免經濟損失。根據此方法可研制開發桑椹縮小型菌核病“檢測試劑盒”產品，廣泛應用于桑葚相關產業的科學研究和生產實踐。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】，通過發現的病原核地杖菌特異性保守DNA序列，獲得了特異性SCAR-PCR引物，建立了桑椹縮小型菌核病SCAR-PCR診斷檢測方法。該方法的靈敏度高(檢測靈敏度為1 pg/μL)，特異性強，使用方便快捷，檢測結果準確可靠，可用于桑椹縮小型菌核病的田間診斷和桑果帶菌情況檢測檢驗；同時還可用于病害潛伏期(已侵染桑果但未顯癥的時期)診斷，從而對病害做出早期預報，以及時實施必要的控制措施，安全有效地防治病害的發生和危害，減輕或避免經濟損失。根據此方法可研制開發桑椹縮小型菌核病“檢測試劑盒”產品，廣泛應用于桑葚相關產業的科學研究和生產實踐。【專利說明】-種快速診斷桑植縮小型菌核病的方法
本專利技術涉及植物病害防治
，特別是涉及一種用分子生物技術快速診斷桑 植縮小型菌核病的方法。
技術介紹
桑植縮小型菌核病的經濟重要性.桑植縮小型菌核病 (S虹unken-fruitsclerotiniose of mu化erry)是H種桑植菌核病之一，其病原菌為核地 |sf {Scleromi trula shiraiana) {Schuamacher T, Holst-Je打se打 /L A sy打opsis of the genus Scleromitrula. 2997,說^分.?仿-化0,是世界上發生最普遍和危 害最嚴重的桑植菌核病。該病在我國發生非常普遍，江蘇、浙江、上海、四川、重慶、陜西和臺 灣等主要果桑種植區均有發生分布，發病率常年均可達到30% - 60%，一般減產20% - 50% ; 近幾年來在許多地區桑菌核病爆發流行，造成大面積果桑毀產絕收（崩兒^填，桌濕巧.桑 堪菌核病病原及病害防治技術綜述.蠶業科學，2012，38巧）：1099-1104)。啦化，棄藤 菌核病是危害果桑作物的重要病害，是影響桑樹生長發育和桑植產量的重要限制因子，研 究該病害的診斷鑒定技術，W準確地預測和有效地防治病害流行，對于桑果生產穩定發展 具有重要意義。 桑植縮小型菌核病發生診斷的重要性.桑菌核病菌W掉落在桑園±壤中的菌核 越冬，次年春季氣溫升高后開始萌發產生子囊盤（磨茹），形成大量子囊抱子散發于空氣 中，在桑樹開花期侵染花朵，果實成熟時表現癥狀，將桑植的部分或全部小果粒變為菌核。 縮小型菌核病植顯著縮小，灰白色，質地堅硬，表面有暗褐色細斑，病植內形成黑色堅硬菌 核。桑植菌核病從病原菌侵染到桑果大量發病的時間歷程很短，病害的快速準確診斷和早 期預報是指導生產中病害防治的關鍵。 桑植縮小型菌核病快捷準確診斷技術的必要性.目前，桑植菌核病的診斷主要采 用傳統病害診斷方法，即根據癥狀和病原菌形態確定病害的種類。但是，傳統的病害診斷需 要病害表現出癥狀之后才能進行，而且需要分離得到病原菌的純培養和對病原菌進行顯微 特征觀察。一方面，病原菌的分離純化過程相當復雜，實驗條件和技術要求都較高，診斷的 準確性和可靠性難W保證；且在人工培養條件下病菌生長緩慢，一般需要15 - 20天之后才 能觀察鑒定，獲得診斷鑒定結果；另一方面，病害一旦開始顯癥，就會迅速發展，此時做出診 斷為時已晚，根據診斷結果采取防治措施已不能獲得有效的病害防治效果。因此急需一種 快速診斷桑植縮小型菌核病的方法。 桑植縮小型菌核病分子診斷技術尚未建立.傳統的真菌分類和鑒定主要基于形 態學特征、致病性測定等，該種方法耗時長、靈敏度低W及經驗性強，從發病的植株中分離 和鑒定病原菌需要很長時間，難W適應現代農業生產中病害預測和綜合防控實踐的需要。 隨著分子生物學的發展，各種分子技術應用到植物病原物的檢測，唐建輝等（2006)利用 RAPD技術轉化為SCAR標記，設計引物RB/RC對西瓜炭痘病菌仿or如'cu7are 進行特異性檢測。Qin et al(2010)應用巢式PCR技術，根據ITS序列，設計出引物XJJ21/ XJJ222對引起油菜菌核病的況'yerWinia s<;?7erWia/Y邸進行特異性檢測。化ang et al (2014)建立了水稻黑條欽縮病毒病的實時PCR定量檢測技術。總之，目前分子生物技術在 植物病害診斷鑒定領域已經廣泛應用，不少重要的植物病害的分子檢測技術都已建立。但 迄今為止，國內外還未見有關核地杖菌DNA特異保守序列（或基因）的發現及桑植縮小型 菌核病分子快捷診斷鑒定方法的研究報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種快速診斷桑植縮小型菌核病的方法。 申請人:通過研 究桑植菌核病病原核地杖菌DNA，篩選出適合的基因CS23進行RATO擴增，獲得了 590bp的 核地杖菌特異性保守序列（SCAR序列，見序列表及實施例），由此設計和篩選出一對能有效 擴增該保守序列的特異性SCAR引物（SSF/SSR)，再通過幾個重要PCR因子的優化，建立了核 地杖菌的SCAR-PCR體系和技術，測試明確技術的靈敏度，并通過桑園采集的田間樣品測試 檢驗技術的實用性和可靠性。 本專利技術所述的一種用分子生物技術快速診斷桑植縮小型菌核病的方法，通過W下 步驟實現： (1) 取待測樣品，采用CTAB方法從樣品中提取總DNA ; (2) 利用5Wbp的核地杖菌特異性保守序列設計并篩選得到核地杖菌的一對特異 性 SCAR-PCR 引物，引物正向序列 SS-F 為 5' - AGTAAAGAGAACATCAAACTTCG -3'，位于特異 序列的8 bp-30 bp;反向序列SS-R為5'- ACTTCCACCGACCA ATCT -3'，位于特異序列的 580bp-596bp ； (3) 進行 PCR 擴增，擴增體系為；2.5yL lOXPCRBuffer; 2.25yLMg2+(25mmol/ 1);2.5111(1饑？3(2.5111111〇1/1);0.625111引物55斗/55-尺（1011111〇1/1);川1模板（10叫/ y L) ;0. 2U rTaq酶；dd&O補足至25 y L ;反應程序為；94°C預變性5min ;94°C變性30s ; 5(TC退火30s ;72°C延伸45s，循環35次；72°C補充延伸5min ;根據擴增條帶診斷桑植縮小 型菌核病。 步驟（1)待測樣品為桑果、桑葉、桑莖、桑根及±壤樣品等。 靈敏度測試表明，在25UL體系中，特異性引物SS-F / SS-R能從質量濃度為 1 pg/uL及其W上的核地杖菌DNA模板中擴增出590 bp的特異性條帶，由此確定該 SCAR-PCR的檢測靈敏度為1 pg/yL。 在田間樣測試試驗中，使用該SCAR-PCR技術檢測24個桑園田間樣品，只有從縮小 型病桑果提取的總DNA中擴增出了 SCAR-條帶序列，從健康桑果、桑葉、桑莖、桑根及±壤樣 品（注：其中含有不同的微生物或動植物殘體）總DNA中均未擴增到SCAR條帶，說明除了 縮小型桑果外，其它樣品均不帶核地杖菌。 本專利技術的重要意義和價值.桑植縮小型菌核病是危害桑樹的重要植物病害，是限 制桑果產業穩定發展的關鍵限制因子。本專利技術通過發現的病原核地杖菌特異性保守DNA序 列，獲得了特異性SCAR-PCR引物，建立了桑植縮小型菌核病SCAR-P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種快速診斷桑椹縮小型菌核病的方法，其特征在于通過以下步驟實現：(1)?取待測樣品，采用CTAB方法從樣品中提取總DNA；(2)?利用590bp的核地杖菌特異性保守序列設計并篩選得到核地杖菌的一對特異性SCAR?PCR引物，引物正向序列SS?F為5'??AGTAAAGAGAACATCAAACTTCG??3'，位于特異序列的8?bp?30?bp；反向序列SS?R為5'??ACTTCCACCGACCA?ATCT??3'，位于特異序列的?580bp?596?bp；(3)?進行PCR擴增，擴增體系為：2.5μL?10×PCR?Buffer；?2.25μL?Mg2+，濃度為25mmol/L；?2.5μL?dNTPs，濃度為2.5mmol/L；0.625μL引物SS?F/SS?R，濃度為10μmol/L；1μL模板，濃度為10ng/μL；0.2U?rTaq酶；?ddH2O補足至25μL；反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s；?50℃退火30s；72℃延伸45s，循環35次；72℃補充延伸5min；根據擴增條帶診斷桑椹縮小型菌核病。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚萬忠，吳舒劼，蘇正川，余洋，畢朝位，楊宇衡，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發明
國別省市：重慶;85