一種快速靈敏的三日瘧原蟲檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種快速、靈敏的三日瘧原蟲檢測方法。本發明專利技術的檢測方法整合了聚合酶鏈式反應PCR和微陣列這兩種強大的分子生物學技術，把PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應室在同一張芯片上；檢測方法包括：標本進行增菌處理，DNA液提取，PCR擴增，雜交，清洗，結果判讀。本發明專利技術能對三日瘧原蟲進行快速靈敏的檢測，通過本發明專利技術可大幅度提高進出口口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止瘧原蟲疫情的發生。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及體外診斷試劑
，具體涉及一種快速靈敏的三日瘧原蟲檢測方 法。
技術介紹
據WHO統計，全球107個國家和地區有瘧疾的流行和傳播，32億人受瘧疾威脅，每 年有3億-5億人發病，死亡人數達100多萬。瘧疾是我國重點防治的五大寄生蟲之一。瘧 疾（malaria)是由瘧原蟲感染引起的危害嚴重的寄生蟲病。感染人類的瘧原蟲有4種：惡 性皰原蟲（Plasmodiumfalciparum,P.f)、間日皰原蟲（Plasmodiumvivax,P.v)、三日皰原 蟲（Plasmodiummalariae，P.m)和卵形痕原蟲（Plasmodiumovale,P.o)。因此，有效的檢 測瘧原蟲是醫學診斷和瘧疾防治必不可少的手段。 目前鏡檢法仍然是"三熱"病人監測和瘧疾臨床病例診斷的主要手段。隨著瘧疾 發病率的下降及原蟲耐藥性的產生，感染人群外周血原蟲密度較低且瘧原蟲形態不典型 的情況變得較為普遍，采用傳統的厚血膜鏡檢費時費力，檢測效率低下。尋求靈敏特異、 簡便快速的瘧疾診斷方法在當前瘧疾的防治工作中顯得非常重要。近年來分子核酸檢測技 術在瘧疾診斷中得到應用，并顯示了良好的發展前景。 以PCR技術為代表的分子生物學手段是現在廣泛應用于瘧原蟲快速檢測的技術。 而由PCR技術發展起來的實時熒光PCR技術以及基因芯片技術等是目前在瘧原蟲檢測中使 用最廣泛的分子生物學方法。實時熒光PCR技術是一種新的PCR方法，是在常規PCR反應 的基礎上增加了能與擴增模板特異性結合的探針，與傳統PCR相比，該方法無需對PCR產物 進行再處理，完全是在封閉狀態下完成檢測的全過程，具有實時、準確、快速等特點，但是由 于對設備要求較高，對工作人員的操作技術難度大，所以不適合快速，準確的檢測。 基因芯片是20世紀90年代發展起來的全新的微量分析技術，它采用微加工和微 電子技術將大量的人工設計好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體 上而得到的一種信息檢測芯片。基因芯片可以同時固定大量的探針分子，理論上可以在一 次實驗中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張芯片檢測某一致病原的各種遺傳學指 標，這為平行檢測多個菌種或同菌種內多個菌株提供了一條便捷的途徑；同時檢測的靈敏 度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發展前景。 基因芯片技術利用待檢測樣品的基因組序列設計針對各種微生物的特異探針，將 該探針（寡核苷酸）點樣于芯片表面，同時在探針兩側設計PCR引物，在引物合成過程中對 其5'端進行熒光標記或在PCR過程中加入熒光標記的dNTP，這樣利用PCR擴增的方法即可 得到標記有熒光染料的待檢測靶標，然后用含有待檢測樣品特異探針的微陣列芯片與標記 的靶標雜交，熒光標記的DNA分子與芯片上相匹配的DNA序列發生雜交反應，使得芯片上的 點呈現出熒光信號，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某 些特定瘧原蟲。 當前用于瘧原蟲檢測的基因芯片檢測已經有些應用于研宄，但是這些基因芯片的 探針點樣多采用手工模式，操作復雜，并且增加了很多假陽性的機會。 本專利技術整合了聚合酶鏈式反應（PCR)和微陣列這兩種強大的分子生物學技術，把 PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應室在同一張芯片上。PCR反 應結束后可以直接加入雜交液進行雜交，操作簡單，節省時間，另外靈敏度可以達到幾十個 Copy的DNA分子。 本專利技術的檢測方法可運用于三日瘧原蟲快速靈敏的檢測，作為血清學試驗及鏡檢 法的可靠補充，提高檢測的準確性和時效性，可大大地降低檢測的周期。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏三日瘧原蟲的檢測方法，本發 明能對三日瘧原蟲基因進行快速靈敏的檢測，通過本專利技術可大幅度提高進出口口岸一線檢 驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的 陽性漏檢問題，從而最大限度地防止疫情的發生和國外瘧疾的傳入。 本專利技術針對三日瘧原蟲特有基因，設計引物，在引物擴增區內設計能夠區別其他 瘧原蟲及親緣關系較近的物種的特異性探針，通過探針特異性驗證、探針靈敏度實驗、方法 特異性實驗等證明該方法可以特異檢測三日瘧原蟲，與常規PCR方法比較，檢測靈敏度明 顯高于常規方法多重PCR擴增產物的檢測最低檢出限為幾十copy，不僅可以滿足日常疫情 安全檢測的要求，甚至可以滿足臨床樣品的檢測要求。 本專利技術所提供的快速、靈敏的三日瘧原蟲檢測方法，包括如下步驟： (1)血液樣本DNA液提取； (2)PCR擴增： a.PCR反應體系包括：PCR反應緩沖液，待測基因特異性正、反向引物，PCRGrade H20,PCRControl,DNA提取液； b.將PCR反應液加入已含有待測基因特異性探針的芯片內，將芯片放入反應室內 進行擴增反應；特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計，能夠區別其他物種；特異性 探針點入芯片上。 (3)雜交：PCR擴增完后，將雜交反應液加入芯片，使雜交液和擴增液都進入到雜 交艙內雜交反應； (4)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測； (5)結果判讀。 步驟（1)中所述的DNA提取可使用血液樣本基因組DNA提取試劑盒提取DNA。取 50uL全血樣本，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA。 步驟⑵中所述根據特有基因ISSrRNA的兩個片段設計的特異性正反引物和探針 為：【主權項】1. ，其特征在于：包括如下步驟： (1) 血液樣本進行DNA液提取； (2) PCR 擴增： a. PCR反應體系包括：PCR反應緩沖液，待測樣本基因特異性正、反向引物，PCR Grade H20, PCR Control, DNA 提取液； b. 將PCR反應液加入已含有待測基因特異性探針的芯片反應室內內，將芯片放入機器 進行擴增反應；特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計，能夠區別其他物種；特異性 探針點入芯片上； (3) 雜交：PCR擴增完后，將雜交反應液加入芯片，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙 內雜交反應； (4) 清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測； (5) 結果判讀； 所述的待測基因為三日瘧特有基因是18SrRNA。2. 根據權利要求1所述的快速靈敏的三日瘧原蟲檢測方法，其特征在于：根據特有基 因ISSrRNA的兩個片段設計的特異性正反引物和探針為： Pml-F:GTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGT(SEQ ID NO 1) Pml-R:GCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCA(SEQ ID NO 2) Probe:ATGAGTGTTTCTTTTAGATAGC(SEQ ID NO 3) 和 Pm2-F:ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC(SEQ ID NO 4) Pm2-R:AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA(SEQ ID NO 5) Probe ：GTATAATTTTTTATGCATGGGAAT(SEQ ID NO 6)〇3. 根據權利要求1所述的快速靈敏的三日瘧原蟲檢測方法，其特征在于：步驟（1)中 所本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種快速靈敏的三日瘧原蟲檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：(1)血液樣本進行DNA液提取；(2)PCR擴增：a.PCR反應體系包括：PCR反應緩沖液,待測樣本基因特異性正、反向引物，PCR?Grade?H2O,PCR?Control,DNA提取液；b.將PCR反應液加入已含有待測基因特異性探針的芯片反應室內內，將芯片放入機器進行擴增反應；特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計，能夠區別其他物種；特異性探針點入芯片上；(3)雜交：PCR擴增完后，將雜交反應液加入芯片，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內雜交反應；(4)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；(5)結果判讀；所述的待測基因為三日瘧特有基因是18SrRNA。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：田楨干，歐元祝，陸曄，邱德義，張子龍，岳巧云，李深偉，秦勝營，李平，
申請(專利權)人：中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局，
類型：發明
國別省市：上海;31