羰基還原酶、工程菌及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種羰基還原酶、工程菌及其應(yīng)用，該羰基還原酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)將通過(guò)半理性定點(diǎn)突變獲得的羰基還原酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞中構(gòu)建工程菌，利用工程菌高效表達(dá)羰基還原酶LkADH，該羰基還原酶可提高不對(duì)稱(chēng)還原6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯的能力，并通過(guò)羰基還原酶LkADH的催化作用實(shí)現(xiàn)從6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯到(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的高濃度生產(chǎn)；本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)采用特定反應(yīng)條件以及底物恒速流加的加樣方式進(jìn)行(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的制備，顯著降低了副產(chǎn)物的積累量，提高了反應(yīng)效率，產(chǎn)品光學(xué)純度高，制備成本較低。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
羰基還原酶、工程菌及其應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種羰基還原酶、工程菌及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
他汀類(lèi)藥物是一類(lèi)羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑藥物，是目前臨床上應(yīng)用廣泛的降血脂藥物。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA還原成3-甲基-3，5-二羥基戊酸的反應(yīng)是膽固醇的生物合成途徑，他汀類(lèi)藥物通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶的合成，可抑制體內(nèi)膽固醇的合成，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，對(duì)以膽固醇升高為主的高血脂癥和冠心病有較好的療效。在結(jié)構(gòu)上，他汀類(lèi)藥物通常由憎水性的剛性平面結(jié)構(gòu)母核和具有雙手性中心的(3R，5S/R)-雙羥基己酸酯組成。其中，阿托伐他汀(Atorvastatin)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)是全新第三代、全合成、高純化、高選擇性的HMG-CoA還原酶抑制劑，多年來(lái)占據(jù)降血脂藥物的主要市場(chǎng)份額。合成阿托伐他汀的關(guān)鍵手性中間體是(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羥基己酸叔丁酯，而合成瑞舒伐他汀的關(guān)鍵手性中間體是(3R，5S)-6-羥基-3，5-二羥基己酸叔丁酯，且這兩個(gè)中間體都可以通過(guò)(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯衍生得到。(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯是一個(gè)擁有兩個(gè)手性中心的化合物，可以通過(guò)已經(jīng)建立好一個(gè)手性中心的(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯通過(guò)不對(duì)稱(chēng)還原得到。因此，開(kāi)展對(duì)(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的合成改進(jìn)，對(duì)兩種他汀類(lèi)藥物的制備方法研究均具有十分重要的作用。目前，報(bào)道的制備(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的方法主要有兩種，一種為化學(xué)酶法，即先采用一種羰基還原酶將4-氯乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱(chēng)還原為(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，再通過(guò)克萊森反應(yīng)與醋酸叔丁酯縮合加長(zhǎng)碳鏈來(lái)合成(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯；另一種是一步酶法，以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯為底物，通過(guò)一種羰基還原酶不對(duì)稱(chēng)還原作用直接生成(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯。與前者相比，后者減少了一步反應(yīng)步驟，過(guò)程更為簡(jiǎn)單，更值得深入研究。具體合成路線(xiàn)如下：現(xiàn)有報(bào)道中，僅發(fā)現(xiàn)來(lái)源于LactobacillusbrevisDSM20054的R型醇脫氫酶能作用于6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，不對(duì)稱(chēng)還原生成(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯(文獻(xiàn)Chemistry-aEuropeanJournal，2001，21：4562-4571)。然而，該步反應(yīng)的底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯在水溶液中不穩(wěn)定，尤其是對(duì)熱和堿敏感，且隨濃度增大自發(fā)降解速率加快，主要生成一種叫呋喃酮的副產(chǎn)物。當(dāng)以醇脫氫酶LbADH為催化劑進(jìn)行8_L罐的放大反應(yīng)時(shí)，采用異丙醇為共底物進(jìn)行NADPH的再生，通過(guò)分批補(bǔ)料的方式流加底物，達(dá)到終濃度為9_g/L，副產(chǎn)物呋喃酮的累積量為6mol％，整個(gè)反應(yīng)的TTN數(shù)為96(文獻(xiàn)BioprocessandBiosystemsEngineering，2008，3：183-191)。該放大工藝的終底物濃度不高，TTN數(shù)較低，在氧化還原酶法不對(duì)稱(chēng)還原的工藝中，輔酶尤其是NADP+的價(jià)格占生產(chǎn)總成本的較大比例，在工業(yè)上，TTN數(shù)大于10000的工藝才是具有比較好的應(yīng)用前景的。因此，如何提高主反應(yīng)的反應(yīng)效率，同時(shí)控制反應(yīng)副產(chǎn)物的量，獲得更高濃度的立體異構(gòu)純的(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，是亟待解決的難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種羰基還原酶、工程菌及其應(yīng)用，該羰基還原酶具有更高的活力，能夠在制備(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的反應(yīng)中，提高TTN數(shù)，減少副產(chǎn)物的量以及生產(chǎn)成本。本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種羰基還原酶，氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種編碼所述的羰基還原酶的基因，堿基序列如SEQIDNO.4所示。該羰基還原酶(簡(jiǎn)稱(chēng)LkADH-mut)，其基因通過(guò)PCR克隆LactobacilluskefirDSM20587的基因組序列后突變獲得，除該羰基還原酶基因外，還獲得了堿基序列如SEQIDNO.5～8所示的基因突變體及其編碼的如SEQIDNO.11～14所示的羰基還原酶。克隆LactobacilluskefirDSM20587的基因組序列后獲得未經(jīng)突變的基因的堿基序列如SEQIDNO.3所示，該基因編碼的羰基還原酶如SEQIDNO.9所示。本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種包含所述的基因的重組載體，具體地，載體為pET30-30a(+)。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種包含所述的基因的工程菌，具體地，宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)菌株。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了所述的工程菌在制備(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種生產(chǎn)(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的方法，包括：(1)制備權(quán)利要求4所述工程菌的靜息細(xì)胞懸液；(2)往靜息細(xì)胞懸液中添加底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯、NADP+/NADPH和氫供體，反應(yīng)制得(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯。反應(yīng)式如下所示：所述的靜息細(xì)胞懸液的制備方法為：將所述的工程菌接種到含卡那霉素的液體試管培養(yǎng)基中，搖床活化后，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.8～1.2時(shí)，加入誘導(dǎo)劑，繼續(xù)培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，用緩沖液重懸，獲得所述的靜息細(xì)胞懸液。優(yōu)選地，所述的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)劑濃度為0.2～0.8mM。所述的氫供體為異丙醇。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，羰基還原酶LkADH一方面催化6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱(chēng)還原生成立體異構(gòu)純的(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，同時(shí)伴隨著還原型輔因子NADPH轉(zhuǎn)化為氧化型輔因子NADP+的過(guò)程；另一方面，羰基還原酶LkADH還將異丙醇氧化為丙酮，同時(shí)再生還原型輔因子NADPH，形成一個(gè)輔因子消耗與再生的閉合回路，推動(dòng)主反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯為底物時(shí)，與
技術(shù)介紹
中報(bào)道的LbADH相比較，Lactobacilluskefir羰基還原酶及其突變體比酶活是
技術(shù)介紹
中報(bào)道的LbADH的0.3～6倍。需要注意的是，該反應(yīng)中底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯在水溶液中不穩(wěn)定，尤其是高溫堿性的水溶液中，易發(fā)生如下副反應(yīng)生成呋喃酮：因此，作為優(yōu)選，所述的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的溫度為18～30℃，反應(yīng)液的pH為5.0～7.0。所述的輔因子為NADP+/NADPH，所述的氫供體為異丙醇，所述的羰基還原酶能利用異丙醇再生NADPH。反應(yīng)液中還添加有含MgCl2的檸檬酸-磷酸氫二鈉-NaOH緩沖液。所述的底物采用恒速流加的方式進(jìn)行加樣。由于水溶液中高底物濃度會(huì)增大副反應(yīng)速率，所以反應(yīng)過(guò)程中底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯不是一次性加入到反應(yīng)體系中，而是通過(guò)一定時(shí)間內(nèi)恒速流加的方式加入，反應(yīng)體系中，所述底物的濃度控制在5～100mM。待底物流加結(jié)束后，需繼續(xù)攪拌反應(yīng)6～22小時(shí)，至HPLC檢測(cè)底物完全耗盡。待反應(yīng)結(jié)束后，用等體積的有機(jī)溶劑萃取2-4次，合并萃取相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，得到黃色油狀目標(biāo)產(chǎn)物，副產(chǎn)物的摩爾量控制在1～40mol％，產(chǎn)品ee值高于99.5％。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專(zhuān)利技術(shù)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種羰基還原酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種工程菌在制備(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯中的應(yīng)用；所述工程菌包含編碼羰基還原酶的基因；所述羰基還原酶的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，編碼羰基還原酶的基因的堿基序列如SEQIDNO.4所示。2.一種生產(chǎn)(S)-6-氯-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，包括：(1)制備權(quán)利要求1所述工程菌的靜息細(xì)胞懸液；(2)往靜息細(xì)胞懸液中添加底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、N...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊立榮，何秀娟，陳少云，吳堅(jiān)平，徐剛，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江;33