桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因、蛋白及其制備方法技術

本發明專利技術首次給出了桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因序列和氨基酸序列，并給出該桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶的制備方法，能夠將UDP-葡萄糖生成槲皮素?3-β-D-葡萄糖甙，具有葡萄糖基轉移酶的功能，且具有表達量大，酶活性高的特點。

【技術實現步驟摘要】
桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因、蛋白及其制備方法
本專利技術屬于生物
，具體涉及桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因(MaUFGT)。
技術介紹
花青素(anthocyanin)屬于類黃酮化合物，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是植物花瓣和果實的主要呈色物質?；ㄇ嗨卮嬖谟谥参锛毎囊号葜?，在不同的pH值條件下，使花瓣呈現五彩繽紛的顏色。自然狀態下，游離態的花青素極少見，主要以糖苷形式存在，花青素常與一個或多個葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色苷?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、抗突變、預防心腦血管疾病及保護肝臟的作用。成熟果實的桑椹，味甜汁多，色澤艷麗，營養豐富，花青素含量極為豐富，這些特征是評價桑椹品質的重要指標。類黃酮3-O-糖基轉移酶(UFGT)以槲皮素為底物，能夠催化UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙，是花青素合成途徑的關鍵基因之一，能將不穩定的花青素轉變成穩定的花青苷，該基因的表達決定與否直接影響花青素含量的積累。因此桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因可應用于桑樹花青素生物合成的調控，改良桑椹的品質。研究發現，制約該基因取得進展的主要因素有：(1)蛋白表達量較低或不表達；(2)表達蛋白以包涵體形式存在；(3)包涵體復性后，蛋白沒有酶活性。因此，探尋UFGT基因的高表達至關重要，尤其是獲得具有活性的蛋白，對該基因的鑒定及功能研究提供了重要的技術支持。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因及其氨基酸序列。一種核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或其互補序列。所述核酸分子編碼桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因。上述核酸分子，其擴增引物為：UFGT-F：5’>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3’，UFGT-R：5’>GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT<3’。一種蛋白分子，其氨基酸序列為SEQIDNO.2。其為桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶。一種載體，包含了上述核酸分子。上述載體，其結構如圖3所示。所述載體是將上述編碼桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因作為目的基因導入恰當的載體構成圖3所示結構的載體。所述載體中，兩個組氨酸標簽基因分別位于目的基因上下游兩側，目的基因，組氨酸標簽等部分有機組合，為蛋白的純化、表達量和酶活的提高提供了有利條件。上述載體，其核苷酸序列為SEQIDNO.3。本專利技術的另一目的在于提供上述桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶的制備方法，所得蛋白表達量大、酶活性高。一種桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶蛋白的制備方法，包括獲取目的基因，構建包含目的基因的載體，載體導入宿主菌，從宿主菌中獲取目的蛋白、目的蛋白純化，目的蛋白復性，所述目的蛋白復性是將純化后的蛋白液依次用透析液I、II、III、IV、V、Vi、VII透析，每種透析液透析4h-8h。透析液I配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.5％SDS，6M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液II配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.5％SDS，4M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液III配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.5％SDS，2M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液IV配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.1％SDS，1M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液V配方：100mMTris.HCI，10mMEDTA，0.1％SDS，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液VI配方：50mMTris.HCl，5mMEDTA，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液VII配方：20mMTris.HCl，2mMEDTA，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)。在桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶的制備過程中，極易造成蛋白的失活，蛋白液出現白色絮狀物或沉淀，本專利技術所得蛋白液透明，避免沉淀或白色絮狀物的產生，而且蛋白液的濃度高，并且不會產生透析袋脹袋問題。上述桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶蛋白的制備方法，上述載體導入宿主菌后，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，28℃培養4h-6h。兼顧了目的基因的表達量高和酶活性高的特點。一種桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶蛋白的制備方法，包括以下步驟：(1)獲取桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因：提取成熟桑椹果實的RNA，反轉錄為cDNA，以其為PCR模板，采用引物UFGT-F和UFGT-R擴增得到SEQIDNO.1；(2)將SEQIDNO.1連接到pMD19-T載體，轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選pET28(a+)-MaUFGT載體陽性克隆，再將此載體轉入大腸桿菌菌株BL21(DE3)感受態細胞；(3)表達宿主菌經卡拉霉素篩選后，培養至OD600nm值為0.6～0.8，加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度為0.4mmol/L，在28℃下培養4h；(4)蛋白純化：將步驟(3)處理后得到的菌體在冰浴中經超聲破碎后，依次用10mmol/L、40mmol/L、100mmol/L、250mmol/L咪唑洗脫液進行Ni-NTA親和層析；(5)蛋白復性：將純化后的蛋白液，在4℃依次用透析液I、II、III、IV、V、VI、VII透析復性，每種透析液透析4h；透析液I配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.5％SDS，6M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液II配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.5％SDS，4M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液III配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.5％SDS，2M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液IV配方：100mMTris.HCl，10mMEDTA，0.1％SDS，1M尿素，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液V配方：100mMTris.HCI，10mMEDTA，0.1％SDS，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液VI配方：50mMTris.HCl，5mMEDTA，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)；透析液VII配方：20mMTris.HCl，2mMEDTA，5％甘油，2mMβ-巰基乙醇(pH8.0)。有益效果1.本專利技術針對桑樹中花青素不穩定、含量較低的問題，提供一個調控桑樹花青素生物合成的基因以及蛋白酶活性的方法。本專利技術首次給出了桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶基因序列和氨基酸序列，并且此桑樹黃酮3-O-糖基轉移酶基因的表達產物能夠將UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙，具有葡萄糖基轉移酶的功能。2.本專利技術采用較低溫度下表達，選擇恰當濃度、恰當的誘導劑(IPTG)誘導，使用不同的表達載體以及復性條件的優化等方式，獲得的MaUFGT蛋白表達量高，酶活性高。3.本專利技術獲得的是類黃酮生物合成途徑的一個關鍵基因，其表達產物具有將UDP-葡萄糖生成槲皮素3-β-D-葡萄糖甙的活性。此外，該專利技術還可以應本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種核酸分子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1或其互補序列。

【技術特征摘要】
1.一種核酸分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1或其互補序列。2.如權利要求1所述的核酸分子，其擴增引物為：UFGT-F：5'>CCGGAATTCATGGCACCATCACCACCTTGCC<3'，UFGT-R：5'>GAAAGCGGCCGCTATCAGTCTTACAACTCCTT<3'。3.一種蛋白分子，其氨基酸序列為SEQIDNO.2。4.一種載體，包含了權利要求1或2所述核酸分子。5.如權利要求4所述的載體，其結構如圖3所示。6.如權利要求4所述的載體，其核苷酸序列為SEQIDNO.3。7.一種桑樹類黃酮3-O-糖基轉移酶蛋白的制備方法，包括獲取權利要求1所述的核酸分子為目的基因，構建包含目的基因的載體，載體導入宿主菌，從宿主菌中獲取目的蛋白、目的蛋白純化，目的蛋白復性，所述目的蛋白復性是將純化后的蛋白液依次用透析液I、II、III、Ⅳ、V、Ⅵ、Ⅶ透析，每種透析液透析4-8h；透析液I配方：100mMTris.HCl，l0mMEDTA，0.5％SDS，6M尿素，5%甘油...

【專利技術屬性】
技術研發人員：余茂德，梁燕梅，李軍，趙愛春，劉長英，戴安娜，王傳宏，王曉紅，吳存容，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發明
國別省市：重慶;85