本發明專利技術公開一種從中藥提取物中定向分離出抗內毒素活性單體的方法，該方法包括如下步驟：中藥提取物上大孔吸附樹脂柱，用乙醇-水梯度洗脫，分別檢測洗脫得到的各組分與Lipid?A的結合活性，得到結合活性最高的組分A1；組分A1上聚酰胺柱，用乙醇-水梯度洗脫，分別檢測洗脫得到的各組分與Lipid?A的結合活性，得到結合活性最高的組分B1；組分B1采用高效液相色譜法分離，分別檢測分離得到的各組分與Lipid?A的結合活性，得到所述抗內毒素活性單體。本發明專利技術利用抗內毒素活性單體與Lipid?A具有高結合活性的特點，逐級分離出目標組分，從而實現活性單體的富集、純化。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫藥
，具體涉及一種從中藥提取物中定向分離藥物活性單體特別是抗內毒素活性單體的方法。
技術介紹
膿毒癥的防治是臨床亟待解決的難題，從天然藥物中篩選并分離提取具有拮抗細菌主要致炎分子(如:G_菌的內毒素(LPS)，是引起膿毒癥的主要啟動子)的單體化合物是解決這一難題的新策略。研宄表明，LPS通過其活性中心Lipid A (類脂A)與髓樣單核細胞膜上的⑶14結合，進而與TLR4受體結合是其發揮生物學活性的主要途徑，因此，阻斷LPS與受體的結合是拮抗LPS導致膿毒癥的關鍵環節之一。中醫中藥在我國具有得天獨厚的條件和豐富的資源，中醫藥在治療膿毒癥方面具有悠久歷史。根據臨床表現，膿毒癥在中醫理論中屬于溫病、熱癥等范疇。中醫用藥的原則是“辨證論治”，故又“同病異治”或“異病同治”等法則。就中藥的性而言，又有“熱者寒之”，“寒者熱之”等用藥原則。這就可以認為在諸多寒性或熱性藥物中，必然有共同的物質基礎，即相關的化學成分。現代研宄認為，中藥的清熱解毒功效主要是由于其有效成分的抗LPS作用和抗病原微生物作用。通過對中草藥抗LPS作用的研宄，現已發現多種中草藥具有較好的拮抗LPS作用:金銀花、連翹、黃芩、青蒿等20余種單味中藥具有體外抗菌、抗LPS作用；由丹參、大黃、甘草等中藥組成的方劑能夠顯著抑制LPS刺激的巨噬細胞活化；金銀花、板蘭根、赤芍、連翹、黃芩等單味中藥具有降低LPS活性的作用，但是從中草藥中分離到具有較好拮抗LPS作用的單體的報道卻甚少。宄其原因，一方面可能由于中藥組成成分極其復雜，分離過程繁瑣；另一方面則由于受技術手段的限制，無法對分離得到的組分進行活性檢測與跟蹤。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種從中藥提取物中定向分離出抗內毒素活性單體的方法。本專利技術實現上述目的所采用的技術方案如下: 一種從中藥提取物中定向分離出抗內毒素活性單體的方法，包括如下步驟: (1)中藥提取物上大孔吸附樹脂柱，用乙醇-水梯度洗脫，分別檢測洗脫得到的各組分與Lipid A的結合活性，得到結合活性最高的組分Al ; (2)將步驟(I)得到的組分Al上聚酰胺柱，用乙醇-水梯度洗脫，分別檢測洗脫得到的各組分與Lipid A的結合活性，得到結合活性最高的組分BI ; (3)步驟(2)得到的組分BI采用高效液相色譜法分離，分別檢測分離得到的各組分與Lipid A的結合活性，得到所述抗內毒素活性單體。進一步，在步驟(2)中，組分Al先用膜過濾除去分子量大于5000 Da的成分后再上聚酰胺柱。進一步，所述中藥提取物為梔子水提取物。HPLC過柱分離時，采用甲醇-水梯度洗脫。本專利技術具有以下優點: 1.目標單體化合物分離具有靶向性:利用抗內毒素活性單體與Lipid A具有高結合活性的特點，收集與Lipid A具有較高結合活性的組分，從而實現目標活性組分的富集、純化并最終獲取活性單體化合物。2.目標單體化合物分離工藝安全:分離過程中主要以毒性低且極易揮發的乙醇作為溶媒或洗脫液，采用膜分離技術去除分子量大于5000 Da的淀粉、蛋白質和樹脂等雜質或無效成分，最大限度的保留活性成分于超濾液中，利于HPLC的純化，符合安全、有效、可控的藥物研發原則。【附圖說明】圖1為FG_1~3與Lipid A的結合反應曲線； 圖2為PA-1~3與Lipid A的結合反應曲線； 圖3為PA-2a、PA-2b與Lipid A的結合反應曲線； 圖4為PA-2a的HPLC圖； 圖5為PA-2a和梔子苷標準品的HPLC圖； 圖6為PA-2a和梔子苷標準品的紫外吸收光譜； 圖7為PA-2a和梔子苷標準品的硅膠G薄層圖。【具體實施方式】以下結合實施例和附圖對本專利技術做進一步詳細說明。實施例1 (I)梔子水提液上AB-8大孔吸附樹脂柱進行層析，用乙醇-水梯度洗脫，具體操作為:梔子水提液以流速8?10 ml/min上樣，上樣結束后，分別以蒸餾水、10%乙醇和50%乙醇(V/V)，流速16?20 ml/min進行淋洗，分別收集淋洗液，依次產生3個組分，分別命名為FG-1 (蒸餾水洗組分)、FG-2 (10%乙醇洗組分)和FG-3 (50%乙醇洗組分)，各組分依次移入R1002型旋轉蒸發儀燒瓶，減壓濃縮，然后低溫冷凍抽干，備用。以Lipid A為靶點，用生物傳感器檢測上述各組分與Lipid A的結合活性。FG-1-3與Lipid A的結合反應曲線如圖1所示，其中以FG-3與Lipid A結合活性最高，RU值為65 arc seconds，因此，選擇FG-3作進一步的分離。(2)依據中醫理論，中藥中分子量大于5000 Da的多為淀粉、蛋白質和樹脂等雜質或無效成分，因此，將FG-3先用UF超濾膜分離成兩個組分:截流組分(分子量大于5000Da)和濾液組分(分子量小于5000 Da)。將其中的濾液組分上聚酰胺柱進行層析，用乙醇-水梯度洗脫，具體操作為:上樣后，分別以蒸餾水、20%乙醇、50%乙醇(V/V)進行洗脫，流速16ml/min,減壓濃縮后負壓抽干，備用。依次產生3個組分，分別命名為PA_1(蒸餾水洗組分)、PA-2 (20%乙醇洗組分)和PA-3 (50%乙醇洗組分)，以Lipid A為靶點，用生物傳感器檢測上述各組分與Lipid A的結合活性。PA-1?3與Lipid A的結合反應曲線如圖2所示，其中以PA-2與Lipid A結合活性最高，RU值為68 arc seconds，因此，選擇PA-2作進一步的分離。(3)步驟(2)得到的PA-2采用高效液相色譜(HPLC)分離，具體操作過程為: HPLC分析 PA-2組分凍干品用甲醇/水(28 / 72，V/V)配制成lmg/ml濃度，10 μ I進樣，流速:Iml/min，檢測波長 240nm ;色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18 (150*4.6mm，5 μ m)柱；柱溫:25°C ;以甲醇(A)和水(B)作為流動相進行梯度洗脫:0~9min, A:B=28:72 ；9~50min,A:B=28:72 ~ 38:62，進行色譜分析。HPLC 制備 根據色譜分析條件對PA-2組分進行HPLC分離制備，檢測波長240 nm ;色譜柱:KF_C18(200*20 mm，10 μm)柱；柱溫:25°C ;流速:20 ml/min ;樣品濃度:2 mg/ml ;進樣體積:20ml，按各色譜峰保留時間順序依次收集洗脫液，減壓濃縮后負壓抽干，備用。HPLC分離獲得2個產物，保留時間分別為:10.589 min (命名為PA_2a)和23.857min(命名為PA-2b)，按步驟(I)的方法分別檢測PA_2a和PA_2b與Lipid A的結合活性，結合反應曲線如圖3所示，其中，以PA-2a與Lipid A的結合活性最高，RU值為112 arcseconds。HPLC分析(圖4)顯示:PA_2a為一對稱的單峰，HPLC峰面積歸一化法檢測，PA_2a純度大于99%，工作站峰純度評估顯示PA-2a的純度因子為999.988，在閾值(990.000)范圍內，以上綜合分析說明PA-2a為單一物質。PA_2a 的鑒定 ①PA-2a與梔子苷標準品的HPLC、紫外全波長掃描和薄層本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種從中藥提取物中定向分離出抗內毒素活性單體的方法，所述方法包括如下步驟：（1）中藥提取物上大孔吸附樹脂柱，用乙醇?水梯度洗脫，分別檢測洗脫得到的各組分與Lipid?A的結合活性，得到結合活性最高的組分A1；（2）將步驟（1）得到的組分A1上聚酰胺柱，用乙醇?水梯度洗脫，分別檢測洗脫得到的各組分與Lipid?A的結合活性，得到結合活性最高的組分B1；（3）步驟（2）得到的組分B1采用高效液相色譜法分離，分別檢測分離得到的各組分與Lipid?A的結合活性，得到所述抗內毒素活性單體。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：伏建峰，史清海，王曉軍，冉繼華，劉正祥，袁文常，葛迪，李曉玲，高婷，王黎，胡科研，
申請(專利權)人：中國人民解放軍蘭州軍區烏魯木齊總醫院，
類型：發明
國別省市：新疆;65
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