本發明專利技術公開了一種抗菌肽VIP類似肽，抗菌肽VIP類似肽為如下氨基酸序列：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN，并提供了一種抗菌肽VIP類似肽的制備方法。抗菌肽VIP類似肽的生產工藝簡單，生產成本低，抑菌能力強且抗菌譜廣，極具市場前景，解決了現有技術存在的結構復雜、抗菌活力不足和抗菌譜不廣的局限性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程
，涉及一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法。
技術介紹
和諧畜牧業是我國當前畜牧業發展的主題，其重要內容之一就是動物-人-自然 的和諧，而動物健康直接關系到動物源性食品品質與安全以及環境。然而，抗生素的大量使 用甚至濫用導致病原菌耐藥性菌株甚至超級細菌產生、抗生素在畜禽產品中殘留以及隨動 物糞尿排出污染環境等一系列嚴峻問題，嚴重影響了畜產品品質和人類健康。因此，研制安 全、高效、環保型防病保健促生長添加劑來替代抗生素已顯得極為迫切。抗菌肽因其具有廣 譜抗菌、耐熱、無毒無藥殘、不易產生耐藥菌株等眾多的優點，其研宄開發已成為世界上研 宄抗生素新產品的前沿性課題，被認為是新型抗生素研宄的新資源和重要途徑。抗菌肽VIP 具有開發為防病保健飼料添加劑的優勢和潛力：（1)結構簡單明確：由28個氨基酸殘基組 成的直鏈肽；（2)具有多種生物學活性，而且活性較強：免疫調節、抗炎，對大腸桿菌、金黃 色葡萄球菌等具有較強的抑殺作用；（3)作用濃度小：由于VIP屬于內源性的胃腸道激素類 抗菌肽（腦腸肽），因此，以較小的作用濃度（nmoL級）就能發揮較強的生物活性。VIP本身 具有的特性使它具有開發為高效、安全的防病保健飼料添加劑的潛力和廣闊的應用前景。 然而，由于抗菌肽天然資源有限，化學合成肽類成本高，而基因工程方法大量表達 抗菌肽使之成為新興飼料和飼料添加劑的途徑更為現實，并顯示出良好前景。隨著對抗菌 肽構效關系、作用機制及其基因表達調控機制認識的不斷深化，設計高效、有利于人類健康 的抗菌肽作為抗生素替代品是完全可行的。利用基因工程方法獲得抗菌肽的嘗試已在原核 和真核體系獲得成功，但異源高效表達抗菌肽仍面臨多種困難，一是抗菌肽的編碼基因轉 錄后的mRNA較小，一般只有100?200bp，同時其表達的抗菌肽在表達細胞中也容易被降 解，很難實現抗菌肽的大量表達；二是抗菌肽具有抗菌作用，表達宿主，如細菌或酵母細胞 表達的抗菌肽會反饋性抑制宿主細胞活性，影響抗菌肽的進一步表達。由此可見，如何進一 步提高表達水平，在高表達的同時充分保持抗菌肽的生物學活性，提高基因表達產物的穩 定性，設計并表達抗菌活性更強、抗菌譜更廣的抗菌肽等都是值得深入探宄的問題。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法，以解決現有技術存在 的結構復雜、抗菌活力不足和抗菌譜不廣的局限性。 本專利技術所采用的技術方案是，一種抗菌肽VIP類似肽，抗菌肽VIP類似肽為如下氨 基酸序列： HSKAVFTKNYTRLRKGjMAVKKYLNS ILN。 本專利技術所采用的另一種技術方案是，一種抗菌肽VIP類似肽的制備方法，按照以 下步驟實施： 步驟1、抗菌肽VIP類似肽基因的合成： 根據GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、結構特征和理化性質，將D3、D8替換 為K3、K8,對其進行改良；改良后的氨基酸序列為：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN ; 將TrxA與改良抗菌肽VIP進行融合表達，在抗菌肽VIP類似肽的核苷酸序列3' 端添加終止密碼子ΤΑΑ，5'端添加了腸激酶（EnterokinaSe，EK)識別序列DDDDK，以便融合 蛋白被EK切割，釋放出具有N端無額外氨基酸的VIP類似肽；使用XhoI和KpnI限制性內 切酶構建重組質粒，在基因兩端分別設計了與pET32a(+)XhoI和KpnI位點相同的序列，便 于雙酶切； 改良后的核苷酸序列為 119bp ：GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTC ACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGC GG， 上述序列中：方框顯示分別為XhoI和KpnI酶切位點；下劃線標識為EK識別序列； TAA為終止密碼子；黑體傾斜部分為VIP類似肽基因序列； 為了獲得上述目的基因，由此設計合成了 3條引物PU P2和P3,引物擴增長度為 119bp，經測序鑒定說明已成功合成該抗菌肽基因；Pl: 5' -GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAG CAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3' ； P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3' ； P3:5' 一CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG-3' ； 上述序列Pl和P2中的方框分別表示XhoI和KpnI酶切位點； 步驟2、抗菌肽VIP類似肽重組大腸桿菌表達載體的構建和鑒定： 對重疊延伸PCR法（SOE-PCR)擴增獲得的基因和pET32a(+)分別同時進行雙酶 切，然后進行連接，以將目的基因構建到到表達載體上，獲得的重組質粒可編碼TrxA-VIP2 融合蛋白。使用雙酶切連接法構建重組質粒時，按外源基因與質粒摩爾數比為3 :1的比例 進行混合，反應體系為10uL，16°C過夜，同樣轉化DH5a感受態細胞，經測序進行鑒定，說明 抗菌肽VIP類似肽的表達載體構建成功； 步驟3、抗菌肽VIP類似肽對大腸桿菌感受態細胞的轉化及誘導表達：將融合表達 質粒 PET32-VIP2 轉化 E.coliBL21(DE3)感受態細胞，得到 pET32-VIP2/BL21(DE3)重組菌； 重組菌接種至15mL LB培養基中過夜培養，以BL21 (DE3)和pET32a(+)為對照，按1%接種 量分別接種于30mL新鮮培養基中，吸光度A_達0. 6左右時用IPTG誘導（終濃度0. 3mmol/ L)，誘導前及誘導后4h分別測定A_，分別取適量的菌體量進行SDS-PAGE ; 步驟4、融合蛋白的純化： 培養 pET32-VIP2/BL21 (DE3)，誘導表達 4h 后收集菌體，用 A 液（20mmol/L PBS+0. 5mol/L NaCl, ρΗ8· 0)清洗，8000r/min 離心 5min，重復清洗 1 次，再以 1:10 的比例 (V :〇D)的比例將菌體重懸于A液，超聲破碎后，4°C 15000r/min離心15min，收集上清液，經 BeaverBeads?金屬離子螯合磁珠進行純化，以含500mmol/L咪挫的洗脫液洗脫，可得到純 化后的融合蛋白TrxA-VIP2 ; 步驟5、抗菌肽VIP類似肽的釋放： 為獲得改良抗菌肽VIP，需用人工引入的腸激酶切割位點切割融合蛋白 TrxA_VIP2,去除擔體蛋白，釋放目標抗菌肽；將純化后的融合蛋白經Sephadex G-25柱脫 鹽和超濾管濃縮后進行腸激酶切割，成功釋放重組表達抗菌肽VIP類似肽。 進一步的，步驟1中的抗菌肽VIP類似肽基因的PCR反應體系為：10XBuffer含 Mg2+5 μ L，dNTP 2. 5mM 4 μ L，引物 P15 μ M 10 μ L，引物 P25 μ M 0· 5 μ L，引物 P35 μ M 10 μ L， pfu 0· 5 yL ;PCR 反應條件為：94°C 預變性 5min ;94°C 30s，60本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種抗菌肽VIP類似肽，其特征在于，所述的抗菌肽VIP類似肽為如下氨基酸序列：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐春蘭，喬想金，孟堯，陳凱，高紫陽，牛衛寧，尚曉婭，
申請(專利權)人：西北工業大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61
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