家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因及其重組表達載體和應用制造技術

本發明專利技術公開了家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因及其重組表達載體和應用，家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因包括BmREEPa-L和BmREEPa-S兩種剪切體，其中BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，BmREEPa-S的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示；經研究發現，家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因與BmNPV感染家蠶相關，當該基因被干涉后，BmNPV對BmN-SWU1細胞的感染明顯被抑制，而當過表達該基因后，BmNPV的感染被明顯促進，表明該基因可用于BmNPV的防治以及抗BmNPV家蠶品系制備，對抗逆家蠶的研究具有重要意義。

【技術實現步驟摘要】
家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因及其重組表達載體和應用
本專利技術屬于生物領域，特別涉及家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因，還涉及還有該基因的重組表達載體和應用。
技術介紹
家蠶是具有重要經濟價值的鱗翅目昆蟲。BmNPV是蠶業生產上最常見且危害最嚴重的一類病原，對蠶業影響巨大。如何利用當今發展迅速的基因工程技術，從根本上提高家蠶病毒抗性，是蠶業領域重要的研究課題。近些年對宿主抗性基因的研究表明，干涉或過表達某些宿主的基因可以影響BmNPV對宿主的感染。因此，干涉或過表達這些宿主基因將成為防治家蠶感染BmNPV的一種有效策略。基因RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指外源性雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引發生物體內同源mRNA降解從而表現出的基因轉錄后沉默現象，現已成為分子生物學家分析基因組功能和基因治療的一個有力工具。小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)是RNAi的效應分子，是一類長21～23個核苷酸的雙鏈RNA，在體內可特異性降解與其序列互補的mRNA而引發RNA沉默。產生siRNA的方法有多種，其中化學合成法簡單易行，但由于siRNA的穩定性較差，在體內易被核酸酶降解，RNAi干擾效應時間短，因而分子生物學家多采用siRNA表達載體法，即將短發卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)對應的DNA模板序列插入載體啟動子后構建RNAi載體，RNAi載體導入體內后持續轉錄出shRNA，shRNA被RNaseⅢ家族的內切核酸酶Dicer剪切成siRNA，從而引發較長時間的RNA沉默效果。因此，利用RNAi技術，以目的基因為靶標構建RNAi載體，再將其導入家蠶細胞并持續表達能夠導致目的基因mRNA降解的siRNA，是防治家蠶感染BmNPV和培育家蠶抗病毒品系的一種有效手段?；蜻^表達是指將基因序列插入到宿主適用的啟動子后，構建目的基因的表達載體，然后將表達載體導入宿主細胞，從而使目的基因在宿主中的表達量上調。利用過表達技術將BmNPV抗性基因導入家蠶細胞以增強的家蠶細胞的BmNPV抗性，同樣也是防治家蠶感染BmNPV和培育家蠶抗病毒品系的一種有效手段。近年來，研究者對REEP基因的研究只局限于哺乳動物中其對受體的增強作用和與各類神經性疾病的關系；昆蟲中，只有果蠅中有研究指出果蠅的REEP1基因與果蠅的抗逆性相關。但迄今為止，尚未見有關家蠶BmREEP基因及其功能的研究報道。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的之一在于提供家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因；本專利技術的目的之二在于提供含有家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因的重組表達載體；本專利技術的目的之三在于提供含有上述重組表達載體的轉化子；本專利技術的目的之四在于提供BmREEPa基因干擾序列或干擾BmREEPa基因表達的RNA干擾載體在制備抗核型多角體病毒家蠶或家蠶細胞中的應用。為實現上述專利技術目的，經過研究后本專利技術提供如下技術方案：1、家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因，所述BmREEPa基因包括BmREEPa-L和BmREEPa-S兩種剪切體，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述BmREEPa-S的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2、含有所述家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因的重組表達載體。進一步，所述重組表達載體為干擾BmREEPa基因表達的干擾載體或含有BmREEPa基因編碼區的過表達載體。進一步，所述干擾BmREEPa基因表達的干擾載體為將BmREEPa基因干擾序列連入經改造的pIZ/V5-His載體而得，所述改造的pIZ/V5-His載體是在pIZ/V5-His載體的HindIII和KpnI之間連入紅色熒光蛋白Dsred表達框的載體。進一步，所述BmREEPa基因干擾序列如SEQIDNo.5所示。進一步，所述含有BmREEPa基因編碼區的過表達載體是將SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示序列連入pIZ/V5-His載體多克隆酶切位點處而得。3、含有所述重組表達載體的轉化體。4、BmREEPa基因干擾序列或干擾BmREEPa基因表達的RNA干擾載體在制備抗核型多角體病毒家蠶或家蠶細胞中的應用。進一步，所述干擾BmREEPa基因表達的RNA干擾載體為將BmREEPa基因干擾序列連入經改造的pIZ/V5-His載體而得，所述改造的pIZ/V5-His載體是在pIZ/V5-His載體的HindIII和KpnI之間連入紅色熒光蛋白Dsred表達框的載體；所述BmREEPa基因干擾序列如SEQIDNo.5所示。更進一步，所述家蠶細胞為家蠶卵巢細胞。本專利技術的有益效果在于：本專利技術提供了一個與BmNPV感染高度相關的宿主基因，能夠改變家蠶細胞對BmNPV的感染能力。利用本專利技術的RNAi載體，可以使家蠶細胞對BmNPV的感染能力下降，達到抗BmNPV的效果；同時也可能為家蠶抗逆性的研究提供新的素材。附圖說明為了使本專利技術的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本專利技術提供如下附圖：圖1為BmREEPa基因兩種剪切體的序列比對結果。圖2為BmREEPa基因干涉與過表達載體的效果檢測。圖3為Control、導入BmREEPa干涉載體、導入BmREEPa過表達載體后感染BmNPV后48h的熒光圖(A為熒光視野，B為白光視野)。圖4為Control、導入BmREEPa干涉載體、導入BmREEPa過表達載體后感染BmNPV48h病毒滴度測定結果。圖5為Control、導入BmREEPa干涉載體、導入BmREEPa過表達載體后感染BmNPV后48hVp39基因的定量檢測結果。具體實施方式下面將結合附圖，對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、BmREEPa基因的克隆從silkDB和transDB中確定其mRNA序列。通過PrimerPremier5.0軟件設計如下PCR特異引物：上游引物BmREEPa-F：5’-tcacattcggttagccactaaaag-3’(SEQIDNo.3)，下游引物BmREEPa-R：5’-cgcataagcgaagtgctgaaa-3’(SEQIDNo.4)。然后以感染BmNPV的家蠶全蠶cDNA為模板，以BmREEPa-F和BmREEPa-R為引物進行PCR擴增，PCR擴增程序為：94℃預變性5分鐘；然后94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。將擴增所得PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后，與pMD19-T載體連接，連接產物轉化大腸桿菌Trans-T1感受態細胞，用含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落，用含有Amp的LB培養基過夜培養后提取質粒，然后進行測序。測序結果顯示擴增獲得的序列為兩個剪切體形式，分別命名為BmREEPa-L和BmREEPa-S，其核苷酸序列分別為SEQIDNo.1和SEQIDNo.2，形成的質粒分別命名為pMD19-T-BmREE本文檔來自技高網...

【技術保護點】
家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因，其特征在于：所述BmREEPa基因包括BmREEPa?L和BmREEPa?S兩種剪切體，所述BmREEPa?L的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述BmREEPa?S的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

【技術特征摘要】
1.家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因，其特征在于：所述BmREEPa基因的剪切體為BmREEPa-L和BmREEPa-S兩種，所述BmREEPa-L的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述BmREEPa-S的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.含有權利要求1所述家蠶受體表達增強蛋白BmREEPa基因的重組表達載體。3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體為干擾BmREEPa基因表達的干擾載體或含有BmREEPa基因編碼區的過表達載體。4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述干擾BmREEPa基因表達的干擾載體為將BmREEPa基因干擾序列連入經改造的pIZ/V5-His載體而得，所述改造的pIZ/V5-His載體是在pIZ/V5-His載體的HindIII和KpnI之間連入紅色熒光蛋白Dsred表達框的載體。5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于：所述BmREEPa基因干擾序列如SEQIDNo.5所示。6.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘敏慧，魯成，董小龍，
申請(專利權)人：西南大學，
類型：發明
國別省市：重慶;85