一種組織工程表皮及其制備方法技術

本發明專利技術屬于組織細胞學和組織工程學領域，公開了一種帶有真皮細胞的組織工程表皮及其制備方法。該帶有真皮細胞的組織工程表皮的制備方法包括：獲得表皮細胞；接種所得表皮細胞，用表皮培養基培養至密度達到80％-100％，之后，更換為混合培養基，培養16h-24h，收集表皮細胞層，得組織工程表皮片；轉移所得組織工程表皮至半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布上，得帶有表皮細胞層的膜；培養真皮細胞，將所得真皮細胞鋪在所得帶有表皮細胞層的膜的表皮細胞層之上，培養1h-2h，即得。本發明專利技術提供的制備方法操作簡單，周期短，可以與受體自身皮膚組織相互刺激和誘導、促進受體完整表皮結構的形成。

【技術實現步驟摘要】
一種組織工程表皮及其制備方法
本專利技術屬于組織細胞學和組織工程學領域，特別涉及一種帶有真皮細胞的組織工程表皮及其制備方法。
技術介紹
皮膚是人體面積最大的器官，承擔著保護身體、排汗、感覺冷熱和壓力等功能，使體內各組織和器官免受物理性、機械性、化學性和病原微生物的侵襲。遺傳疾病、燒燙傷、慢性皮膚創傷(如糖尿病)、白癜風、白化病等很多原因會對皮膚造成損害，影響皮膚美觀、使皮膚留下疤痕甚至失去生理功能。當皮膚受到嚴重損害，如深度的大面積燒燙傷時，皮膚不能再進行自我恢復，會失去對細菌的抵御作用，導致大量細菌通過皮膚侵入人體，極易引發全身感染而導致死亡。目前，最普遍的治療皮膚燒燙傷的方法是采用手術移植人體自身其他部位沒有損傷的皮膚至燒燙傷處，但是這種方法有很大局限性，具體體現在：首先，當皮膚大面積燒傷時，人體自身的正常皮膚來源有限；其次，移植后的皮膚存活率低，這也是臨床上皮膚移植面臨的重大挑戰。因此，利用體外培養技術來擴增皮膚細胞，在體外構建出組織工程皮膚，并通過組織工程皮膚移植來治療皮膚創傷具有重要的意義。長期以來，皮膚學專家和皮膚科醫生一直致力于具有生理功能的人類皮膚的再生研究。組織工程表皮早在20多年前就用于大面積燒傷的治療，對提高燒傷病人的成活率起著重要作用，但普通的組織工程表皮產品移植到人體后有很多局限性，如表皮易起水泡不平整、表皮容易過度增生，而且因為沒有真皮細胞通常會造成疤痕的收縮，不能形成真正具有完整生理功能的皮膚。因此，目前人工組織表皮除了用于臨時覆蓋傷口降低死亡率之外，在臨床上的應用還比較少。近幾年組織工程全程皮(包含表皮和真皮)，即在體外用培養的表皮和真皮細胞結合膠原蛋白而形成的，引起了人們的重視。越來越多的此類產品進入臨床應用于創傷愈合，并且獲得了較好的療效。然而，目前的組織工程全層皮的制備方法復雜，需要較長時間的培養才能形成皮膚結構，嚴重限制了其推廣和應用。另外人工真皮在臨床上也有應用，但由于不帶有活性細胞而且沒有表皮部分形成不了正常的皮膚，造成其應用的局限性。
技術實現思路
為了彌補現有技術的不足，本專利技術提供了一種帶有真皮細胞的組織工程表皮及其制備方法。本專利技術提供的帶有真皮細胞的組織工程表皮的制備方法簡單、周期短，所得組織工程表皮可以與受體自身皮膚組織相互刺激和誘導、促進受體完整表皮結構的形成，可以形成帶有毛發、皮脂腺、皮下脂肪等功能性的完整皮膚。本專利技術是通過如下技術方案實現的：本專利技術提供了一種帶有真皮細胞的組織工程表皮的制備方法，包括如下步驟：步驟1：獲得表皮細胞；步驟2：接種所得表皮細胞，用表皮培養基培養至密度達到80％-100％，之后，更換為混合培養基，培養16h-24h，收集表皮細胞層，得組織工程表皮片；所用混合培養基包含胎牛血清、DMEM培養基和F12培養基；步驟3：轉移所得組織工程表皮至半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布上，得帶有表皮細胞層的膜；其中，表皮細胞層的分化細胞層與半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布接觸；步驟4：培養真皮細胞，將所得真皮細胞鋪在所得帶有表皮細胞層的膜的表皮細胞層之上，培養1h-2h，即得；其中真皮細胞為從皮膚真皮中分離的真皮細胞或所述從皮膚真皮中分離的真皮細胞和黑色素細胞的混合物。在本專利技術中，真皮細胞為從皮膚真皮中分離的真皮細胞中的一種或幾種，其包含真皮成纖維細胞、成纖維細胞前體細胞、脂肪及脂肪前體細胞、毛乳頭細胞、血管內皮細胞；或者從皮膚真皮中分離的真皮細胞中的一種或幾種細胞和黑色素細胞的混合物。本專利技術通過專利技術人大量的創造性勞動，意外發現在獲得表皮細胞層之后，將表皮細胞層轉移到半滲透性聚合物、或硅膠膜底物、或凡士林紗布上，獲得帶有表皮細胞層的膜，最后，加入真皮細胞通過較短時間的孵育，使真皮細胞完全附著表皮細胞，即得到了帶有真皮細胞的組織工程表皮。本專利技術提供的制備方法簡單、周期短，且所得組織工程表皮能夠與受體自身皮膚組織相互刺激和誘導、促進受體完整表皮結構的形成。實驗結果證實，當真皮細胞為真皮成纖維細胞與黑色素細胞的混合物時，所得的帶有真皮細胞的組織工程表皮在移植動物之后，能夠形成完整的皮膚結構，具有成熟毛囊、汗腺、皮脂腺，且具有自身愈合能力。在本專利技術的一些實施例中，本專利技術提供的制備方法中的真皮細胞具體為從皮膚真皮中分離的真皮細胞中的一種或幾種細胞和黑色素細胞的混合物。優選地，本專利技術提供的制備方法中，步驟1中表皮細胞的制備方法為：取皮膚組織，用中性蛋白酶孵育10h-20h，之后分離表皮，得表皮；取所得表皮，切碎后，用胰酶酶解，收集，即得表皮細胞。在本專利技術中，表皮細胞的來源不受本專利技術提供的制備方法的限制，本領域技術人員能夠根據實際情況購買或者制備表皮細胞。本專利技術中所用到的皮膚組織可以是任何皮膚組織，例如胚胎、新生兒或成人的任何皮膚組織。在本專利技術的一些實施例中，本專利技術提供的制備方法中，所用到的皮膚組織為成人包皮組織。優選地，本專利技術提供的制備方法中，步驟2中的接種之前，還包括表皮細胞的傳代培養；接種所用的表皮細胞為P1代表皮細胞、P2代表皮細胞或P3代表皮細胞。在本專利技術中，P1代細胞為原代分離的細胞傳過1代之后的細胞；P2代細胞為原代分離的細胞傳過2代之后的細胞；P3代細胞為原代分離的細胞傳過3代之后的細胞。在本專利技術的一些實施例中，本專利技術提供的制備方法，包括如下步驟：步驟(1)：表皮細胞分離：(1-a)采集含有表皮的皮膚組織；(1-b)將所述皮膚組織消毒后用含雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗；(1-c)將所述沖洗后的皮膚組織切成長條狀，浸沒于中性蛋白酶酶液中，0℃-4℃消化孵育12h-20h；(1-d)分離所述消化孵育后的長條狀皮膚組織，收集表皮部分，得表皮，切碎成粘稠狀，制得表皮勻漿；(1-e)將所述表皮勻漿置于含胰酶的磷酸鹽緩沖液中在37℃下消化25分鐘-35分鐘，制得表皮細胞懸液；(1-f)向所述表皮細胞懸液中加入含胎牛血清的DMEM培養基，中和表皮細胞懸液；(1-g)過濾中和后的表皮細胞懸液，離心、收集沉淀，得表皮細胞；步驟(2)：所述表皮細胞的傳代培養：將所述表皮細胞作為初始細胞，接種，培養至密度達80％－100％，進行傳代；所述傳代操作具體包括：(2-a)將培養至密度達80％-100％的表皮細胞用磷酸鹽緩沖液洗去殘留的血清后，浸沒于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5分鐘－15分鐘；(2-b)在顯微鏡下觀察，當表皮細胞從培養板中脫落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培養基中和后，離心，收集沉淀；向所述沉淀中加入含雙抗的F12培養基重懸細胞后，離心分離，收集沉淀，得原代表皮細胞；(2-c)將所述原代表皮細胞按1:2-3的比例傳代，所述傳代次數為1代-5代；步驟(3)：組織工程表皮片培養：(3-a)鋪所述P1代表皮細胞、所述P2代表皮細胞或所述P3代表皮細胞到細胞培養皿中，鋪板密度在50％-80％，然后加入表皮培養基培養；每隔一天更換新的所述表皮培養基；(3-b)當細胞密度達80％-100％后，將表皮培養基換成混合培養基；所述混合培養基含胎牛血清、DMEM培養基和F12培養基；(3-c)培養16-24小時后，用磷酸鹽緩沖液沖洗，之后浸沒于中性蛋白酶酶液中，在37℃下培養30分鐘-45分鐘，至表皮細胞成片分離下來，收集表本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種帶有真皮細胞的組織工程表皮的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1：獲得表皮細胞；步驟2：接種所述表皮細胞，用表皮培養基培養至密度達到80％?100％，之后，更換為混合培養基，培養16h?24h，收集表皮細胞層，得組織工程表皮片；所述混合培養基包含胎牛血清、DMEM培養基和F12培養基；步驟3：轉移所述組織工程表皮片至半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布上，得帶有表皮細胞層的膜；其中，所述表皮細胞層的分化細胞層與所述半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布接觸；步驟4：培養真皮細胞，將所得真皮細胞鋪在所述帶有表皮細胞層的膜的表皮細胞層之上，培養1h?2h，即得；所述真皮細胞為從皮膚真皮中分離的真皮細胞或所述從皮膚真皮中分離的真皮細胞和黑色素細胞的混合物。

【技術特征摘要】
1.一種帶有真皮細胞的組織工程表皮的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1：獲得表皮細胞；步驟2：接種所述表皮細胞，用表皮培養基培養至密度達到80％-100％，之后，更換為混合培養基，培養16h-24h，收集表皮細胞層，得組織工程表皮片；所述混合培養基包含胎牛血清、DMEM培養基和F12培養基；步驟3：轉移所述組織工程表皮片至半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布上，得帶有表皮細胞層的膜；其中，所述表皮細胞層的分化細胞層與所述半滲透性聚合物、或硅膠模底物、或凡士林紗布接觸；步驟4：培養真皮細胞，將所得真皮細胞鋪在所述帶有表皮細胞層的膜的表皮細胞層之上，培養1h-2h，即得；所述真皮細胞為從皮膚真皮中分離的真皮細胞或所述從皮膚真皮中分離的真皮細胞和黑色素細胞的混合物。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述表皮細胞的制備方法為：取皮膚組織，用中性蛋白酶孵育12h-20h，之后分離表皮，得表皮；取所述表皮，切碎后，用胰酶酶解，收集，即得表皮細胞。3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述接種之前，還包括表皮細胞的傳代培養；所述接種所用的表皮細胞為P1代表皮細胞、P2代表皮細胞或P3代表皮細胞。4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，其包括如下步驟：步驟(1)：表皮細胞分離：(1-a)采集含有表皮的皮膚組織；(1-b)將所述皮膚組織消毒后用含雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗；(1-c)將所述沖洗后的皮膚組織切成長條狀，浸沒于中性蛋白酶酶液中，0℃-4℃消化孵育12h-20h；(1-d)分離所述消化孵育后的長條狀皮膚組織，收集表皮部分，得表皮，切碎成粘稠狀，制得表皮勻漿；(1-e)將所述表皮勻漿置于含胰酶的磷酸鹽緩沖液中在37℃下消化25分鐘-35分鐘，制得表皮細胞懸液；(1-f)向所述表皮細胞懸液中加入含胎牛血清的DMEM培養基，中和表皮細胞懸液；(1-g)過濾中和后的表皮細胞懸液，離心、收集沉淀，得表皮細胞；步驟(2)：所述表皮細胞的傳代培養：將所述表皮細胞作為初始細胞，接種，培養至密度達80％－100％，進行傳代；所述傳代操作具體包括：(2-a)將培養至密度達80％-100％的表皮細胞用磷酸鹽緩沖液洗去殘留的血清后，浸沒于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5分鐘－15分鐘；(2-b)在顯微鏡下觀察，當表皮細胞從培養板中脫落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培養基中和后，離心，收集沉淀；向所述沉淀中加入含雙抗的F12培養基重懸細胞后，離心分離，收集沉淀，得原代表皮細胞；(2-c)將所述原代表皮細胞按1:2-3的比例傳代，所述傳代次數為1代-5代...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳訓偉，邢志青，王景昆，
申請(專利權)人：蘇州磐升生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32