MicroRNA 221?3p在制備表皮細(xì)胞中的方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及—種MicroRNA221?3p在促表皮細(xì)胞增殖的新用途。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了MicroRNA221?3p在制備促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用，所述試劑包括但不限于：1)MicroRNA221?3p；2)含有MicroRNA?221?3p編碼基因的重組載體；3)含有MicroRNA?221?3p編碼基因的重組病毒；4)含有MicroRNA?221?3p編碼基因的重組病毒載體。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)實(shí)驗(yàn)證明，MicroRNA221?3p可以抑制PTEN的表達(dá)，顯著提高表皮細(xì)胞的增殖速度，且表皮細(xì)胞的特性并未丟失。此說(shuō)明，MicroRNA221?3p與表皮細(xì)胞增殖有關(guān)。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)為表皮細(xì)胞快速增殖以及更快獲得組織工程皮膚的種子細(xì)胞提供了新的思路和方式。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物
，尤其涉及—種MicroRNA221-3p在促表皮細(xì)胞增殖中的新用途，也即一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，及其將該方法應(yīng)用于制備皮膚移植物。
技術(shù)介紹
皮膚有重要的保障作用，因其位于體表，所以，經(jīng)常發(fā)生皮膚的各種創(chuàng)傷。皮膚創(chuàng)面修復(fù)是燒創(chuàng)傷治療的重要組成部分，繼各種皮瓣和微粒皮用于移植手術(shù)后，近年來(lái)又興起了表皮細(xì)胞培養(yǎng)和體外構(gòu)建皮膚組織的組織工程技術(shù)，并已成為醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)(Rhett?JM,Ghatnekar?GS,Palatinus?JA,O'Quinn?M,Yost?MJ,Gourdie?RG.Novel?therapies?for?scar?reduction?and?regenerative?healing?of?skin?wounds.TrendsBiotechnol.2008Apr；26(4):173-80)表皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)技術(shù)可為大面積深度燒傷創(chuàng)面的治療提供充足的皮膚組織細(xì)胞。但是，表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)條件苛刻，增殖緩慢，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。體外培養(yǎng)表皮細(xì)胞以游離方式或組織工程皮膚的方式應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面，是以表皮細(xì)胞修復(fù)皮膚創(chuàng)面的一種新方法。MicroRNA(miRNA)是由21-25個(gè)核苷酸構(gòu)成的分子，MicroRNA通過(guò)抑制其靶分子mRNA的翻譯或者促進(jìn)其降解而起到負(fù)性基因表達(dá)調(diào)控作用，隨著近年研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)微小RNA分子在細(xì)胞功能及器官發(fā)育中有著廣泛的作用，如MicroRNA參與了胚胎的早期發(fā)育過(guò)程。在皮膚的發(fā)育過(guò)程中，有報(bào)道稱(chēng)miR-205可調(diào)控皮膚干細(xì)胞增殖(Wang?D,Zhang?Z,O'Loughlin?E,Wang?L,Fan?X,Lai?EC,Yi?R.MicroRNA-205?controls?neonatal?expansion?of?skin?stem?cells?by?modulating?the?PI(3)K?pathway.Nat?Cell?Biol.2013?Oct；15(10):1153-63)，miR-21是一種可調(diào)控表皮細(xì)胞中BMP的功能(Ahmed?MI,Mardaryev?AN,Lewis?CJ,Sharov?AA,Botchkareva?NV.MicroRNA-21?is?an?important?downstream?component?of?BMP?signalling?in??epidermal?keratinocytes.J?Cell?Sci.2011?Oct?15；124(Pt?20):3399-404.)，進(jìn)而調(diào)控表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，MicroRNA-221可抵消或抑制細(xì)胞周期抑制劑p27的作用，從而促進(jìn)肥大細(xì)胞增殖(Mayoral?RJ,Pipkin?ME,Pachkov?M,van?Nimwegen?E,Rao?A,Monticelli?S.MicroRNA-221-222?regulate?the?cell?cycle?in?mast?cells.J?Immunol.2009?Jan?1；182(1):433-45)。另有研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-221-3p和肝細(xì)胞的增殖密切相關(guān)(Yuan?Q,Loya?K,Rani?B,S,Balakrishnan?A,Lamle?J,Cathomen?T,Vogel?A,Manns?MP,Ott?M,Cantz?T,SharmaAD.MicroRNA-221?overexpression?accelerates?hepatocyte?proliferation?during?liver?regeneration.Hepatology.2013?Jan；57(1):299-310)。MicroRNA與細(xì)胞功能的研究越來(lái)越多，但目前尚無(wú)MicroRNA-221-3p過(guò)表達(dá)可促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的研究及應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供MicroRNA221-3p的新用途，本專(zhuān)利技術(shù)的另一目的在于提供一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，本專(zhuān)利技術(shù)的第三目的在于提供MicroRNA221-3p或者利用MicroRNA221-3p促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法在制備組織工程皮膚和皮膚移植物中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)為了克服表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)(制備)中增殖緩慢的缺陷，提高表皮細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)中的臨床應(yīng)用效果，提供了借助MicroRNA—具體為MicroRNA221-3p來(lái)實(shí)現(xiàn)表皮細(xì)胞快速增殖的新方法。本專(zhuān)利技術(shù)所述的MicroRNA221-3p，Accession?number：MIMAT0000278，具體序列如下：agcuacauugucugcuggguuuc(SEQ?ID?NO:1)。本專(zhuān)利技術(shù)的第一方面，提供了MicroRNA221-3p的新用途，即MicroRNA221-3p在制備促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用。所述的試劑，為提高M(jìn)icroRNA221-3p表達(dá)量的試劑，包括但不限于以下任一：A)MicroRNA221-3p；B)含有MicroRNA?221-3p編碼基因的重組載體；C)含有MicroRNA?221-3p編碼基因的重組病毒；D)含有MicroRNA?221-3p編碼基因的重組病毒載體。所述的MicroRNA221-3p，經(jīng)查找人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，由位于X染色體的基因簇編碼，其基因序列定位于Xp11.3。其序列如SEQ?ID?NO:1所示。所述的MicroRNA?221-3p前體(MI0000298)，其序列如下：UGAACAUCCAGGUCUGGGGCAUGAACCUGGCAUACAAUGUAGAUUUCUGUGUUCGUUAGGCAACAGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUCAGGCUACCUGGAAACAUGUUCUC(SEQ?ID?NO:2)。所述的促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，是指體外培養(yǎng)的條件下，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或慢病毒感染的方式上調(diào)表皮細(xì)胞中的MicroRNA?221-3p，和陰性對(duì)照相比，MicroRNA221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞增殖速度加快。本專(zhuān)利技術(shù)的第二方面，提供一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，該方法包括：構(gòu)建一種MicroRNA?221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞。較佳地，該方法包括Ⅰ)和Ⅲ)、或者Ⅱ)和Ⅲ)：Ⅰ)人工合成MicroRNA221-3p的成熟體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，獲得MicroRNA?221-3py高表達(dá)的的表皮細(xì)胞；Ⅱ)構(gòu)建含有MicroRNA221-3p的編碼基因的重組載體、構(gòu)建含有MicroRNA221-3p的編碼基因的重組病毒，或構(gòu)建含有MicroRNA221-3p的編碼基因的重組病毒載體(簡(jiǎn)稱(chēng)為GFP-MIR-221-3p)；將獲得的重組載體、重組病毒，或重組病毒載體轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞，獲得MicroRNA221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞；Ⅲ)步驟Ⅰ)或Ⅱ)得到的MicroRNA221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞，放入37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基同未做處理的表皮細(xì)胞，均為20％胎牛血清，高糖DMEM。本專(zhuān)利技術(shù)在本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
MicroRNA221?3p在制備促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】
1.MicroRNA221-3p在制備促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MicroRNA221-3p在制備促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試
劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑，為提高M(jìn)icroRNA221-3p表達(dá)量的
試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MicroRNA221-3p在制備促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的試
劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑包括以下任一：
A)MicroRNA221-3p；
B)含有MicroRNA?221-3p編碼基因的重組載體；
C)含有MicroRNA?221-3p編碼基因的重組病毒；
D)含有MicroRNA?221-3p編碼基因的重組病毒載體。
4.一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的體外培養(yǎng)表皮細(xì)胞方法，其特征在于，該方法
包括構(gòu)建一種MicroRNA?221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞，體外培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的體外培養(yǎng)表皮細(xì)胞方法，
其特征在于，構(gòu)建一種MicroRNA?221-3p高表達(dá)的表皮細(xì)胞，選自步驟Ⅰ)
或者步驟Ⅱ)：
Ⅰ)人工合成MicroRNA221-3p的成熟體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，獲得
MicroRNA?221-3py高表達(dá)的的表皮細(xì)胞；
Ⅱ)構(gòu)建含有MicroRNA221-3p的編碼基因的重組載體、構(gòu)建...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉厚奇，仵敏娟，徐辰，夏照帆，王越，徐莎，熊俊，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31