表達豬pCD163的細胞系、其制備方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)中基因表達領(lǐng)域，特別涉及一種表達豬pCD163的細胞系，通過RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因，將其插入真核表達載體pCI-neo中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163，將真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細胞并擴大培養(yǎng)即得。所述的細胞系在臨床分離PRRSV病毒和生產(chǎn)PRRSV疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)構(gòu)建的pCD163-MARC細胞系可以在病毒滴度較低的情況下快速、高效地增殖PRRSV，突破了PRRSV增殖率低的局限性；對臨床樣品的PRRSV分離率高，病毒增殖滴度高，更加適合于疫苗生產(chǎn)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
表達豬pCD163的細胞系、其制備方法及應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及生物技術(shù)中基因表達領(lǐng)域，特別涉及一種表達豬pCD163的細胞系，還涉及此細胞系的制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS），俗稱“豬藍耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起，病毒感染后可以導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、返情、產(chǎn)死胎或弱仔、仔豬死亡及各種年齡的豬不同程度的呼吸道癥狀，并且能破壞豬的免疫系統(tǒng)，引起混合感染或繼發(fā)感染。我國于1995年底爆發(fā)此病，并迅速蔓延到全國多個省份。在許多規(guī)模化豬場，PRRS陽性率很高，有的可達80%以上。自2006年以來，我國部分地區(qū)豬場發(fā)生了由PRRSV變異株導(dǎo)致的高致病性藍耳病。該病在臨床上以發(fā)病豬高熱、呼吸困難、皮膚發(fā)紅為主要特征，具有更高的發(fā)病率和死亡率，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極為嚴重的經(jīng)濟損失。現(xiàn)階段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。PRRSV表現(xiàn)出相當(dāng)嚴格的細胞嗜性，PRRSV在感染豬體時，其主要的靶細胞為肺泡巨噬細胞（PAM），在體外培養(yǎng)時，則只能在CL2621、MARC-145等細胞中增殖。PAM非常容易感染PRRSV，但是PAM難于獲得且只能原代培養(yǎng)，操作成本高昂，無法在PRRSV的疫苗生產(chǎn)中使用；MARC-145細胞雖然可以增殖PRRSV，但是存在著增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的局限性。CD163是PRRSV細胞受體，可以單獨介導(dǎo)PRRSV的吸附和內(nèi)吞。研究發(fā)現(xiàn)，將CD163分子導(dǎo)入PRRSV非易感細胞，使該細胞表達CD163蛋白后就能夠感染并增殖PRRSV，成為PRRSV易感細胞。CD163在MARC-145細胞中的表達量很低，導(dǎo)致了MARC-145細胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低。公開號為CN103525773A的中國專利技術(shù)專利申請，公開了一種提高豬藍耳病病毒靶細胞感染滴度的方法及其應(yīng)用。通過構(gòu)建能夠表達豬藍耳病病毒受體硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA受體中的單個或多個的Marc145細胞或MA-104細胞，再利用該細胞接種豬藍耳病病毒，收集病毒液，豬藍耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可進一步用于藍耳病疫苗生產(chǎn)。說明書中具體實施方式詳細公開了細胞系的構(gòu)建方法及病毒培養(yǎng)效價，構(gòu)建過程中使用的載體為pIRES2-EGFP。利用能表達豬藍耳病病毒受體細胞接種病毒，可連續(xù)收獲病毒且收獲病毒滴度提高2～5倍，而所制備疫苗的效力并沒有降低，在不增加額外生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上，使單位時間產(chǎn)能提高2～5倍。本專利技術(shù)人認為，上述效果還有進一步提升的空間。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中pCD163在MARC-145細胞中的表達量低，導(dǎo)致了MARC-145細胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的問題，本專利技術(shù)提供了一種可以在病毒滴度較低的情況下快速、高效地增殖PRRSV的表達豬pCD163的細胞系pCD163-MARC。本專利技術(shù)還提供了所述細胞系pCD163-MARC的制備方法。本專利技術(shù)還提供了所述細胞系pCD163-MARC的應(yīng)用。本專利技術(shù)是通過以下步驟得到的：一種表達豬pCD163的細胞系，通過以下步驟得到的：通過RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因，將其插入真核表達載體pCI-neo中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163，將真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細胞并擴大培養(yǎng)即得。根據(jù)GenBank公布的pCD163的基因序列（GenBankNo:HM991330）設(shè)計一對擴增pCD163受體基因序列的引物，序列如下：pCD163-Fwd(XhoI):5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev(NotI):5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。所述的細胞系，優(yōu)選RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因，PCR反應(yīng)體系為25μL，含cDNA1μL，Mg2+1.5mmoL/L，dNTP200μmoL/L，10×LAPCRBuffer2.5μL，pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)各400nmoL/L，TaKaRaLATaq2U；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C5min；然后進行35個循環(huán)，循環(huán)條件為95°C45s，61°C45s，72°C1min；然后72°C延伸10min。所述的細胞系在臨床分離PRRSV和生產(chǎn)PRRSV疫苗中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用，優(yōu)選將含有PRRSV的病料樣品接種至所述的細胞系，盲傳5代，出現(xiàn)明顯CPE的為分離到病毒。所述的應(yīng)用，優(yōu)選將所述的細胞系感染PRRS疫苗株，培養(yǎng)若干小時后收毒，用于疫苗的生產(chǎn)。采集健康豬肺臟分離PAM（豬肺泡巨噬細胞），提取RNA，通過RT-PCR擴增獲得pCD163基因。然后將該基因插入真核表達載體pCI-neo中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，通過G418進行抗性篩選。采用有限稀釋法獲得單克隆細胞并擴大培養(yǎng)，IFA、Westernblot鑒定獲得的細胞系，通過pCD163-MARC與CN103525773A中的細胞系對PRRSV增殖的差異比較試驗，證實pCD163-MARC細胞系增殖PRRSV的優(yōu)勢。本專利技術(shù)所構(gòu)建的pCD163-MARC細胞系比CN103525773A中公開的Marc-145/CD163細胞（以下簡稱對照細胞）對PRRSV增殖的滴度提高了100.6-0.7TCID50，更適合于臨床PRRSV的分離和疫苗生產(chǎn)。本專利技術(shù)的有益效果是：（1）本專利技術(shù)構(gòu)建的pCD163-MARC細胞系可以在病毒滴度較低的情況下快速、高效地增殖PRRSV，突破了以往MARC-145細胞系PRRSV增殖率低的局限性；（2）通過病毒增殖實驗證明，在相同的條件下，本專利技術(shù)構(gòu)建的pCD163-MARC細胞系對臨床樣品的PRRSV分離率高，病毒增殖滴度高，更加適合于疫苗生產(chǎn)。附圖說明：圖1為從PAM細胞中擴增出的pCD163基因電泳圖，其中1和2均為pCD163RT-PCR產(chǎn)物，M為DL15,000DNAMarker，圖2為本專利技術(shù)重組真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163XhoI/NotI雙酶切鑒定圖譜，其中1和3代表兩個不同重組陽性質(zhì)粒XhoI/NotI雙酶切結(jié)果；2和4代表兩個不同重組陽性質(zhì)粒對照；M為DL15,000DNAMarker，圖3為間接免疫熒光（IFA）檢測兩種細胞中CD163蛋白的表達情況，其中左圖為MARC-145細胞，右圖為本專利技術(shù)構(gòu)建的pCD163-MARC細胞系，圖4為Westernblot檢測兩種細胞中CDl63蛋白的表達情況，其中1為MARC-145細胞中CD163蛋白的表達情況，2為本專利技術(shù)構(gòu)建的pCD163-MARC細胞系中CD163蛋白的表達情況，下部分為β-actin內(nèi)參，圖5為PRRSV經(jīng)典株SD-1株(A)和高致病性毒株SD-JN株(B)感本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種表達豬pCD163的細胞系，其特征是通過以下步驟得到的：通過RT?PCR擴增獲得pCD163受體基因，將其插入真核表達載體pCI?neo中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI?pCD163，將真核表達質(zhì)粒pCI?pCD163轉(zhuǎn)染MARC?145細胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細胞并擴大培養(yǎng)即得。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達豬pCD163的細胞系，其特征是通過以下步驟得到的：通過RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因，將其插入真核表達載體pCI-neo中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163，將真核表達質(zhì)粒pCI-pCD163轉(zhuǎn)染MARC-145細胞，通過G418進行抗性篩選，獲得單克隆細胞并擴大培養(yǎng)即得;RT-PCR擴增獲得pCD163受體基因中使用的引物序列如下：pCD163-Fwd:5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev:5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：杜以軍，王金寶，叢曉燕，陳蕾，齊靜，孫文博，吳家強，陳智，于江，郭立輝，任素芳，
申請(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37