一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體及制備方法及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體及制備方法及應(yīng)用，其制備方法為：(1)單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物的制備；(2)琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物的制備；(3)單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物的制備；(4)多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的制備，本發(fā)明專利技術(shù)提供的基因載體可以高效負(fù)載基因，連接的多肽可以有效地與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的α4β1整合素結(jié)合，提高該聚陽(yáng)離子基因載體與基因形成的復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞表面的富集。本發(fā)明專利技術(shù)提供的多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體可以應(yīng)用于內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，基因轉(zhuǎn)染效率高。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體及制備方法及應(yīng)用，屬于具有生物靶向識(shí)別功能的基因載體

技術(shù)介紹
在發(fā)達(dá)國(guó)家及中等發(fā)達(dá)國(guó)家，心腦血管疾病已經(jīng)成為威脅人類生命安全的最主要疾病之一。目前對(duì)于心腦血管疾病的介入治療主要是基于小口徑人工血管的構(gòu)建。但是小口徑人工血管術(shù)后往往引起再狹窄和血栓，會(huì)對(duì)患者的生命安全造成二次威脅。研究表明，對(duì)人工血管材料表面實(shí)現(xiàn)快速全面的內(nèi)皮化是解決再狹窄及血栓的有效方法。基因治療和多肽靶向治療可以有效實(shí)現(xiàn)快速全面內(nèi)皮化。基因治療就是將目的基因?qū)塍w內(nèi)，通過目的基因的表達(dá)達(dá)到治愈的效果。有效的基因載體是基因治療得以成功的關(guān)鍵。常用的基因載體有兩類，一類是病毒類的，一類是非病毒類的。由于病毒類載體存在安全系數(shù)低、制備難度大和對(duì)目的基因要求程度高等問題，在實(shí)際應(yīng)用中不如非病毒類載體應(yīng)用廣泛。非病毒載體有多種，但效果最好的是聚乙烯亞胺類。考慮到高數(shù)均分子量聚乙烯亞胺的毒性，因此在實(shí)際研究中低數(shù)均分子量的聚乙烯亞胺是廣受歡迎的。我們課題組一直致力于研究可生物降解的聚陽(yáng)離子型基因載體。可通過自組裝的技術(shù)，有效提高載體表面的正電荷密度，高效負(fù)載基因，同時(shí)可生物降解的聚合物核又不會(huì)帶來高的生物毒性。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面具有區(qū)別于其他種類細(xì)胞的膜蛋白受體，可以特異性的識(shí)別一些多肽分子。REDV(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸)多肽就能夠與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的α4β1整合素發(fā)生特異性的識(shí)別作用，從而提高REDV多肽在內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附。如果將REDV多肽接枝到基因載體表面，通過REDV多肽與內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合作用，可以提高基因復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞表面的富集，從而增加基因復(fù)合物被內(nèi)吞的概率，基因轉(zhuǎn)染效率就會(huì)隨之增加。目前對(duì)于這種REDV多肽靶向的基因載體在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面的研究還較少。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是在提供一種生物靶向識(shí)別性能好，轉(zhuǎn)染效率高，生物毒性低的多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體。本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的制備方法。本專利技術(shù)的第三個(gè)目的是提供一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的應(yīng)用。本專利技術(shù)的技術(shù)方案概述如下：一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的制備方法，包括如下步驟：(1)琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)的制備：在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將數(shù)均分子量為5800-10500的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(I)，琥珀酸酐以及催化劑4-二甲氨基吡啶，縛酸劑三乙胺加入到溶劑無(wú)水二氧六環(huán)中使溶解，在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)20-30h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗產(chǎn)物，真空干燥，干燥物用N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜溶解，用截留分子量為5000-10000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍干燥，得到白色的琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)，所述單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩爾比為1:(5-10):(5-10):(3-6)，所述單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物中親水段單甲醚封端的聚乙二醇數(shù)均分子量為2000-3500，疏水段聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)的數(shù)均分子量為3800-7000；(2)單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的制備：在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，以摩爾比為1：(5-10)：(5-10)：(4-6)，將式(II)所示共聚物、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、數(shù)均分子量為1800-3500的支鏈的聚乙烯亞胺加入到N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中使溶解，在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)18-28h，用截留分子量為5000-10000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍干燥，得到白色的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)；(3)由式(III)共聚物合成多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體(IV)：在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，按比例將1質(zhì)量份的式(III)所示共聚物、0.1-0.2質(zhì)量份的數(shù)均分子量為2000的兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇，加入到混合溶劑中使溶解，在避光條件下，于室溫下反應(yīng)2-4h，加入簡(jiǎn)寫為CREDVW的多肽，室溫下反應(yīng)4-6h，產(chǎn)物用截留分子量為5000-12000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍干燥，得到白色的多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體(IV)，所述混合溶劑為2體積份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸緩沖溶液和3體積份的二甲基亞砜混合而成；所述兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇與CREDVW多肽的摩爾比為1：(0.7-1)。上述方法制備的一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體。上述多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體在提高內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率方面的應(yīng)用。本專利技術(shù)的一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體集靶向識(shí)別與基因治療于一身。通過CREDVW多肽中的REDV多肽與內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素的特異性識(shí)別作用，可以提高基因載體復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞表面的富集，從而增強(qiáng)基因復(fù)合物被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞的概率，目的基因在內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率就會(huì)隨之增加。附圖說明圖1A為單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(I)的1HNMR圖。圖1B為琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)的1HNMR圖。圖1C為單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的1H?NMR圖。圖2為熒光性能比較圖：(1)0.50mg/mL的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的發(fā)射光譜圖，(2)0.78mg/mL多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體(IV)的發(fā)射光譜圖，(3)0.15mg/mL的CREDVW多肽的發(fā)射光譜圖。(mPEG-P(LA-co-CL)-PEI指代單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物，mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV指代多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體)。圖3為多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的透射電鏡圖。圖4為多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布圖。圖5為多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體與pZNF580基因形成的復(fù)合物在不同氮磷比(N/P)結(jié)合時(shí)的流體學(xué)粒徑和Zeta電位分布圖。圖6為多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體與pZNF5本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征是包括如下步驟：(1)琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)的制備：在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將數(shù)均分子量為5800?10500的單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)嵌段共聚物(I)，琥珀酸酐以及催化劑4?二甲氨基吡啶，縛酸劑三乙胺加入到溶劑無(wú)水二氧六環(huán)中使溶解，在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)20?30h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗產(chǎn)物，真空干燥，干燥物用N,N?二甲基甲酰胺或二甲基亞砜溶解，用截留分子量為5000?10000的透析管在蒸餾水中透析48?60h，冷凍干燥，得到白色的琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)，所述單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)嵌段共聚物、琥珀酸酐、4?二甲氨基吡啶和三乙胺的摩爾比為1:(5?10):(5?10):(3?6)，所述單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)嵌段共聚物中親水段單甲醚封端的聚乙二醇數(shù)均分子量為2000?3500，疏水段聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)的數(shù)均分子量為3800?7000；(2)單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)?聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的制備：在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，以摩爾比為1：(5?10)：(5?10)：(4?6)，將式(II)所示共聚物、(1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N?羥基琥珀酰亞胺、數(shù)均分子量為1800?3500的支鏈的聚乙烯亞胺加入到N,N?二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中使溶解，在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)18?28h，用截留分子量為5000?10000的透析管在蒸餾水中透析48?60h，冷凍干燥，得到白色的單甲醚封端的聚乙二醇?聚(乳酸?co?己內(nèi)酯)?聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)；(3)由式(III)共聚物合成多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體(IV)：在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，按比例將1質(zhì)量份的式(III)所示共聚物、0.1?0.2質(zhì)量份的數(shù)均分子量為2000的兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇，加入到混合溶劑中使溶解，在避光條件下，于室溫下反應(yīng)2?4h，加入簡(jiǎn)寫為CREDVW的多肽，室溫下反應(yīng)4?6h，產(chǎn)物用截留分子量為5000?12000的透析管在蒸餾水中透析48?60h，冷凍干燥，得到白色的多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體(IV)，所述混合溶劑為2體積份的pH＝8.4的0.1mol/L磷酸緩沖溶液和3體積份的二甲基亞砜混合而成；所述兩端分別為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的聚乙二醇與CREDVW多肽的摩爾比為1：(0.7?1)。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種多肽修飾的聚陽(yáng)離子基因載體的制備方法，其特征是包括如下步驟：
(1)琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)的制備：
在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將數(shù)均分子量為5800-10500的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己
內(nèi)酯)嵌段共聚物(I)，琥珀酸酐以及催化劑4-二甲氨基吡啶，縛酸劑三乙胺加入到溶劑無(wú)
水二氧六環(huán)中使溶解，在室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)20-30h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗產(chǎn)物，真
空干燥，干燥物用N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜溶解，用截留分子量為5000-10000的透析
管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍干燥，得到白色的琥珀酰化的單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳
酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物(II)，所述單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共
聚物、琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩爾比為1:(5-10):(5-10):(3-6)，所述單
甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)嵌段共聚物中親水段單甲醚封端的聚乙二醇數(shù)均
分子量為2000-3500，疏水段聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)的數(shù)均分子量為3800-7000；
(2)單甲醚封端的聚乙二醇-聚(乳酸-co-己內(nèi)酯)-聚乙烯亞胺嵌段共聚物(III)的制
備：
在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，以摩爾比為1：(5-10)：(5-10)：(4-6)，將式(II)所示共聚物、(1-(3-<...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馮亞凱，王海霞，郭錦棠，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：天津大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：天津;12