一種高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生產β-丙氨酸中的應用制造技術

本發明專利技術公開了一種工程菌及其在生產β-丙氨酸中的應用。本發明專利技術提供的工程菌，其構建方法依次包括如下步驟：（1）將目的蛋白的編碼基因插入載體pET-30a(+)的多克隆位點，得到的重組質粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示；（2）將步驟（1）得到的重組質粒pET30-panDB導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到所述工程菌。本發明專利技術還保護一種生產β-丙氨酸的方法，以L-天冬氨酸為底物，采用所述工程菌進行生物轉化，得到β-丙氨酸。采用本發明專利技術提供的方法制備β-丙氨酸，無需添加誘導劑，整個過程無需高溫、高壓，同時具有條件溫和、操作簡單、對環境友好等優點，已達工業化應用水平。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生產β-丙氨酸中的應用。
技術介紹
β-丙氨酸（β-alanine），即3-氨基丙酸（3-aminopropanoic），是自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸，β-丙氨酸是一種重要的生化原料，可以用于合成泛酸、肌肽、帕米膦酸鈉、巴柳氮等，在醫藥、飼料和食品領域有著十分廣泛的應用。目前β-丙氨酸的合成方法主要有化學法和生物法。化學法合成β丙氨酸主要有丙烯腈法、丙烯酸法及琥珀酰亞胺降解法。丙烯腈法使用丙烯腈和氨水氨化反應生成β-氨基丙腈，再在酸性或堿性條件下水解即得，該方法原料易得、成本較低，但有副反應，且水解過程中生成大量無機鹽，產物較難純化。丙烯酸法使用丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸鹽與氨水氨化反應，在較高的溫度和壓力條件下得到β-丙氨酸，合成工藝簡單、收率高，但卻需要高溫高壓。琥珀酰亞胺法是指將琥珀酰亞胺在堿性氯酸鈉溶液中發生降解得到β-丙氨酸，該法的工藝條件要求苛刻，原料成本較高且易發生其它副反應，不適合工業化。總之，化學合成法的原料、中間體有毒，同時反應條件比較苛刻，要求高溫高壓，對環境污染嚴重。生物法合成β-丙氨酸，國內相關報道的主要有兩種，一種是使用藤黃八疊球菌將丙烯酸轉化為β-丙氨酸（轉化率為54%），另一種是使用大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主，表達來源于大腸桿菌的L-天冬氨酸α羧化酶，最終產β-丙氨酸2.94g/L，遠遠達不到工業化的水平。
技術實現思路
本專利技術通過篩選不同來源的L-天冬氨酸α羧化酶，構建了基因工程菌，通過酶活比較，提供了一種高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生產β-丙氨酸中的應用。本專利技術提供的工程菌，其構建方法依次包括如下步驟：（1）將目的蛋白的編碼基因插入載體pET-30a(+)的多克隆位點，得到的重組質粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示；（2）將步驟（1）得到的重組質粒pET30-panDB導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到所述工程菌。所述目的蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。所述重組質粒pET30-panDB具體可為在載體pET30的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位點之間插入所述目的蛋白的編碼基因得到的重組質粒。本專利技術還保護所述工程菌在生產β-丙氨酸中的應用。所述應用具體可為以L-天冬氨酸為底物生產β-丙氨酸。本專利技術還保護一種重組質粒，是將目的蛋白的編碼基因插入載體pET-30a(+)的多克隆位點，得到的重組質粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示。所述目的蛋白的編碼基因具體可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。本專利技術還保護所述重組質粒在生產β-丙氨酸中的應用。本專利技術還保護一種生產β-丙氨酸的方法，包括如下步驟：以L-天冬氨酸為底物，采用所述工程菌進行生物轉化，得到β-丙氨酸。所述生物轉化的條件可為37℃、450rpm。所述生物轉化的時間具體可為1-15小時。所述的方法中，所述工程菌通過如下方法擴大培養：①挑取工程菌的單菌落，接種于10mL含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基，37℃、200rpm振蕩培養12小時；②取步驟①得到的整個培養體系，接種于100mL含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基，30℃、200rpm振蕩培養12h，離心收集菌體。本專利技術中通過篩選不同來源的L-天冬氨酸α羧化酶，提供了一株高產β-丙氨酸基因工程菌，該菌株可以穩定的高表達L-天冬氨酸α羧化酶，將L-天冬氨酸轉化成β-丙氨酸，酶活達2.09U/mL，轉化15h后β-丙氨酸的產量為178g/L，轉化率達99%。采用本專利技術提供的方法制備β-丙氨酸，無需添加誘導劑，整個過程無需高溫、高壓，同時具有條件溫和、操作簡單、對環境友好等優點，已達工業化應用水平。附圖說明圖1為標準品溶液的HPLC圖譜。圖2為工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁進行步驟3得到的上清液的酶活。圖3為生物轉化過程中轉化體系中生成的β-丙氨酸濃度。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。載體pET-30a(+)：Novagen公司。大腸桿菌BL21(DE3)：Novagen公司。L-天冬氨酸標準品：生工生物工程（上海）股份有限公司，產品編號AB0091CAS(56-84-8)。β-丙氨酸標準品：生工生物工程（上海）股份有限公司，產品編號A6168CAS(107-95-9)。實施例1、重組質粒和工程菌的構建序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子即大腸桿菌BL21(DE3)中L-天冬氨酸α-羧化酶的編碼基因。序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子即谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium?glutamicum）中L-天冬氨酸α-羧化酶的編碼基因。序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子即結核分枝桿菌（Mycobacterium?tuberculosis）中L-天冬氨酸α-羧化酶的編碼基因。序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子即枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）中L-天冬氨酸α-羧化酶的編碼基因。一、工程菌甲的構建1、重組質粒pET30-panDE的構建（1）合成序列表的序列1所示的雙鏈DNA分子。（2）以步驟（1）合成的雙鏈DNA分子為模板，用Ec-pand-for和Ec-pand-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。Ec-pand-for：5’-GGCTTCCATATGATTCGCACGATGCTGC-3’；Ec-pand-rev：5’-TTACGGGGTACCTCAAGCAACCTGTACCGGAA-3’。（3）用限制性內切酶NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切步驟（2）的PCR擴增產物，回收酶切產物。（4）用限制性內切酶NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切載體pET-30a(+)，回收約5300bp的載體骨架。（5）將步驟（3）的酶切產物和步驟（4）的載體骨架連接，得到重組質粒pET30-panDE。根據測序結果對重組質粒pET30-panDE進行結構描述如下：在載體pET-30a(+)的NdeⅠ和KpnⅠ酶切位點之間插入了序列表的序列1自5’末端第4至381所示的雙鏈DNA分子。2、工程菌甲的構本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種工程菌，其構建方法依次包括如下步驟：（1）將目的蛋白的編碼基因插入載體pET?30a(+)的多克隆位點，得到的重組質粒pET30?panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示；（2）將步驟（1）得到的重組質粒pET30?panDB導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到所述工程菌。

【技術特征摘要】
1.一種工程菌，其構建方法依次包括如下步驟：
（1）將目的蛋白的編碼基因插入載體pET-30a(+)的多克隆位點，得到的重組質
粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示；
（2）將步驟（1）得到的重組質粒pET30-panDB導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到所
述工程菌。
2.如權利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述目的蛋白的編碼基因如序列表
的序列5所示或如序列表的序列4所示。
3.一種重組質粒，是將目的蛋白的編碼基因插入載體pET-30a(+)的多克隆位點，
得到的重組質粒pET30-panDB；所述目的蛋白如序列表的序列6所示。
4.如權利要求3所述的重組質粒，其特征在于：所述目的蛋白的編碼基因如序列
表的序列5所示或如序列表的序列4所示。
5.權利要求1或2所述的工程菌，或，權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡真，張君麗，鄧思穎，李寅，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11