本發(fā)明專利技術(shù)提供了包含用于改進(jìn)的DNA合成反應(yīng)(具有改進(jìn)的反應(yīng)性)的冷休克蛋白質(zhì)的組合物，使用這些組合物用于合成DNA的方法，在這些方法中使用的試劑盒，以及通過這些方法產(chǎn)生的DNA組合物。本發(fā)明專利技術(shù)進(jìn)一步提供用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的包含冷休克蛋白質(zhì)的組合物，使用這些組合物用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的方法，以及在這些方法中使用的試劑盒。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
冷休克蛋白質(zhì)組合物和用于其用途的方法以及試劑盒本申請是申請日為2009年3月2日、申請?zhí)枮?00980106857.9、專利技術(shù)名稱為“冷休克蛋白質(zhì)組合物和用于其用途的方法以及試劑盒”的專利技術(shù)專利申請的分案申請。優(yōu)先權(quán)聲明本申請要求提交于2008年2月29日的美國臨時申請?zhí)?1/067,596，提交于2008年10月9日的美國臨時申請?zhí)?1/195,747，以及提交于2008年5月16日的日本申請?zhí)?008-129745的優(yōu)先權(quán)，這些公開的內(nèi)容在此處全部并入本文作為參考。序列列表隨本文一并提交書寫形式的及計算機(jī)可讀形式的序列列表。計算機(jī)可讀形式記錄的信息與書寫形式的序列列表是相同的。專利技術(shù)背景在研究領(lǐng)域，將DNA的合成用于多種目的。其中，除了化學(xué)合成短鏈DNA如寡聚核苷酸之外，通過使用了DNA聚合酶的酶促方法進(jìn)行DNA合成中的大部分。PCR可在體外容易地擴(kuò)增所需要的核酸片段，有極高的價值，并已經(jīng)成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和其他領(lǐng)域中不可缺少的工具。在由PCR擴(kuò)增DNA的過程中，許多情況下都要求反應(yīng)的高特異性。盡管開發(fā)了新型DNA聚合酶，也優(yōu)化了反應(yīng)混合物的組成以減少非-特異性擴(kuò)增，但是仍然需要對PCR擴(kuò)增特異性的改進(jìn)。除了使用DNA作為模板材料的傳統(tǒng)PCR方法之外，還可使用RNA-依賴的DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)DNA的合成。在研究領(lǐng)域中，常常有必要分析衍生自多種基因的mRNA分子。逆轉(zhuǎn)錄酶使得用RNA作為模板合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成為可能，并且因此，已經(jīng)在對mRNA分子的分析上實現(xiàn)了卓越的進(jìn)步。通過在克隆技術(shù)和PCR技術(shù)的應(yīng)用，其中使用了逆轉(zhuǎn)錄酶的mRNA分子的分析現(xiàn)在在遺傳學(xué)研究中是不可缺少的實驗技術(shù)，并且已經(jīng)成為多種領(lǐng)域如生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)中絕對必要的技術(shù)。迄今已經(jīng)產(chǎn)生了一些手段以改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)性，例如，已經(jīng)研究了在高溫下進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程；在其中使用了逆轉(zhuǎn)錄酶以及具有3’-5’外切核酸酶活性的酶的cDNA合成過程(JP專利號3910015)；其中使用了核酸-結(jié)合蛋白質(zhì)如Ncp7、recA、SSB及T4gp32的過程(WO00/55307)；等等。盡管有一些對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)性的改進(jìn)，然而可能無法合成全長的cDNA，并且甚至在如今，有些情況下所合成的cDNA的量可能不足。因此，對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)性的改進(jìn)仍然是正進(jìn)行的大事，必須要進(jìn)一步改進(jìn)。除了對上文描述的兩種DNA合成方法的改進(jìn)之外，在科學(xué)領(lǐng)域還需要可以確定內(nèi)切核糖核酸酶的切割位點(diǎn)特異性的技術(shù)。例如，mRNA干擾酶為存在于廣泛的細(xì)菌基因組中的毒素-抗毒素系統(tǒng)編碼的序列-特異性內(nèi)切核糖核酸酶。這些內(nèi)切核糖核酸酶通常具有單鏈RNA內(nèi)的特異性切割位點(diǎn)：大腸桿菌(E.coli)MazF在ACA序列處特異性切割，ChpBK在ACY序列處(Y為U、A或G)特異性切割，來自質(zhì)粒R100的PemK在UAH序列處(其中H為C、A或U)特異性切割，來自結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的MazF-mt1和MazF-mt6分別在UAC和U富含區(qū)域特異性切割。最近，有發(fā)現(xiàn)來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的MazF同源物在VUUV’處進(jìn)行切割(其中V和V’為A、C或G，且可以相同或不相同)。然而確定分支結(jié)核桿菌的一些MazF同源物的切割特異性的之前嘗試卻失敗了。尤其是對于確定其中識別長于三個堿基的特異性序列的切割特異性，使用足夠長以覆蓋所有可能的靶標(biāo)序列的RNA底物是至關(guān)重要的。使用長RNA作為底物的一個主要問題在于盡管其為單鏈RNA，卻形成非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。為了使用這種或任何其他長RNA作為內(nèi)切核糖核酸酶的底物，必須解折疊其二級結(jié)構(gòu)。因此，還有對開發(fā)用以確定內(nèi)切核糖核酸酶如mRNA干擾酶的切割-位點(diǎn)特異性的新技術(shù)的需要。在多種微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有冷休克蛋白質(zhì)，人們認(rèn)為其在對生長溫度下移的適應(yīng)中起到一些作用。其中，已經(jīng)鑒定CspA為一種主要的冷休克蛋白質(zhì)。從大腸桿菌(Escherichiacoli)中分離出編碼CspA的基因，并使用其基因產(chǎn)生了重組CspA(見WO90/09444)。然而，冷休克蛋白質(zhì)的常規(guī)提出的應(yīng)用限于其作為冷凍保護(hù)蛋白質(zhì)的用途，其保護(hù)農(nóng)田中不受冷凍或霜凍損害。本專利技術(shù)提供了用于改進(jìn)的DNA合成反應(yīng)(具有改進(jìn)的反應(yīng)性)的包含冷休克蛋白質(zhì)的組合物，使用這些組合物用于合成DNA的方法，在這些方法中使用的試劑盒，以及通過這些方法產(chǎn)生的組合物。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的包含冷休克蛋白質(zhì)的組合物，使用這些組合物用于鑒定內(nèi)切核糖核酸酶切割位點(diǎn)的方法，以及在這些方法中使用的試劑盒。專利技術(shù)概述根據(jù)本專利技術(shù)，提供了使用DNA聚合酶用于DNA合成的組合物，使用這種組合物用于合成DNA的方法，用于這種DNA合成方法的試劑盒，以及根據(jù)所提供這種方法合成的DNA組合物。本專利技術(shù)的一個目標(biāo)是使得使用DNA聚合酶進(jìn)行DNA合成成為可能，其中反應(yīng)的反應(yīng)性得到改進(jìn)。本專利技術(shù)的一個實施方式涉及用于DNA合成的組合物，其包含冷休克蛋白質(zhì)和DNA聚合酶。在本專利技術(shù)的特定實施方式中，作為此冷休克蛋白質(zhì)的示例為CspA或其同源物，優(yōu)選地，為衍生自大腸桿菌的CspA或其同源物。組合物可包含超過0.5μg的CspA每25μL組合物。根據(jù)這種實施方式的組合物可包含兩種或多種DNA聚合酶。進(jìn)一步地，根據(jù)這種實施方式的組合物可包含至少一種引物和至少一種脫氧核苷酸。這種組合物可進(jìn)一步包括液體媒介物，如反應(yīng)緩沖溶液。本專利技術(shù)的一個進(jìn)一步的實施方式包含A)冷休克蛋白質(zhì)；B)至少一種選自DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸、和DNA的組分；以及C)液體媒介物。本專利技術(shù)的一個進(jìn)一步的實施方式涉及合成DNA的方法，其包括步驟：A)制備包含冷休克蛋白質(zhì)、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷三磷酸、和DNA的混合物；以及B)孵育步驟A)中制備的混合物。本專利技術(shù)的另一個實施方式涉及用于DNA合成的試劑盒，其包含冷休克蛋白質(zhì)和DNA聚合酶。根據(jù)這種實施方式的試劑盒可進(jìn)一步包含液體媒介物或關(guān)于如何使用試劑盒的紙質(zhì)或電子形式的說明書。這種試劑盒的組分可單獨(dú)地或分開地存在。本專利技術(shù)還涉及由包括以下步驟的方法合成的DNA組合物：A)制備包含冷休克蛋白質(zhì)、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷的混合物、和DNA；以及B)孵育步驟A)中制備的混合物。本專利技術(shù)還涉及有利地用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，使用所述組合物的cDNA合成方法，有利地用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑盒，以及由此方法合成的cDNA組合物。根據(jù)本專利技術(shù)，可實現(xiàn)這種令人滿意的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其在特異性、合成鏈的長度、合成量等等方面是出眾的。本專利技術(shù)的一個實施方式涉及用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，其包含冷休克蛋白質(zhì)或其同源物；和逆轉(zhuǎn)錄酶。在根據(jù)本專利技術(shù)的這種實施方式中，冷休克蛋白質(zhì)的實例是CspA或其同源物，CspA的一個實例為衍生自大腸桿菌的CspA。在一些實施方式中，CspA可以從大約0.5μg-大約20μgCspA每20μL的組合物的量存在。逆轉(zhuǎn)錄酶的實例為衍生自莫洛尼鼠類白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或衍生自禽成髓細(xì)胞瘤病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或其組合。進(jìn)一步地，根據(jù)本專利技術(shù)的此實施方式中的組合物可進(jìn)一步包含至少一種引物和至少一種脫氧核苷酸。組本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于DNA合成的組合物，其包含冷休克蛋白質(zhì)或其同源物；以及DNA聚合酶。
【技術(shù)特征摘要】
2008.05.16 JP 2008-129745;2008.02.29 US 61/067,5961.用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，其包含衍生自大腸桿菌的CspA以及逆轉(zhuǎn)錄酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中逆轉(zhuǎn)錄酶是衍生自莫洛尼鼠類白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶或衍生自禽成髓細(xì)胞瘤病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶或其組合。3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種引物以及至少一種脫氧核糖核苷酸。4.權(quán)利要求3的組合物，其進(jìn)一步包含液體媒介物。5.權(quán)利要求4的組合物，其中液體媒介物包括反應(yīng)緩沖溶液。6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包含大約0.5μg-大約20μg的CspA每20μL的組合物。7.權(quán)利要求3的組合物，其進(jìn)一步包含寡聚dT引物或具有隨機(jī)序列的寡聚核苷酸引物或其組合。8.用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的組合物，其包含：A)衍生自大腸桿菌的CspA；B)逆轉(zhuǎn)錄酶，和至少一種選自引物、脫氧核糖核苷酸、和RNA的組分；以及C)液體媒介物。9.用于合成cDNA的方法，其包括步驟：A)制備包含衍生自大腸桿菌的CspA、逆轉(zhuǎn)錄酶、至少一種引物、至少一種脫氧核糖核苷酸、和RNA的混合物；以及B)孵育步驟A)中制備的混合物。...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：井上正順，S·費(fèi)德塔里，加藤郁之進(jìn)，L·朱，向井博之，上森隆司，西脅一惠，
申請(專利權(quán))人：新澤西內(nèi)科與牙科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US
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