用于改變活細(xì)胞中存在的目標(biāo)RNA分子的序列的寡核苷酸制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及基因治療領(lǐng)域，更具體地，涉及用于改變活細(xì)胞中存在的目標(biāo)RNA分子的序列的寡核苷酸。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】用于改變活細(xì)胞中存在的目標(biāo)RNA分子的序列的寡核苷酸專(zhuān)利
本專(zhuān)利技術(shù)涉及基因治療領(lǐng)域，更具體地，涉及用于改變活細(xì)胞中存在的目標(biāo)RNA分子的序列的寡核苷酸。
技術(shù)介紹
許多種遺傳病是由基因組中的突變引起的。若干類(lèi)型的修飾已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在基因組中發(fā)生突變：一個(gè)或若干個(gè)堿基對(duì)的缺失、基因序列中的一個(gè)或若干個(gè)錯(cuò)配、一個(gè)或若干個(gè)核苷酸的插入、或重復(fù)三聯(lián)體的反復(fù)以及整個(gè)或一部分基因的缺失或重復(fù)。由一個(gè)或若干個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)配、缺失或插入導(dǎo)致的遺傳病包括囊性纖維化、肌肉萎縮癥、鐮狀細(xì)胞性貧血、血友病、β-地中海貧血、脆性X綜合征。可以利用RNA修復(fù)在RNA水平上修復(fù)遺傳缺陷。寡核苷酸及其復(fù)合物已經(jīng)被用作修復(fù)DNA修飾的治療分子(IPapaioannou,JPSimons,JSOwen,Oligonucleotide-directedgene-editingtechnology:mechanismsandfutureprospects(寡核苷酸引導(dǎo)的基因編輯技術(shù)：機(jī)制和未來(lái)展望),ExpertOpin.Biol.Ther.(2012)12(3):329-342)。這些寡聚物可以包含RNA和/或DNA核苷酸、或修飾的RNA或DNA核苷酸。采用它們獲得缺陷DNA的位點(diǎn)特異性修復(fù)。預(yù)期修復(fù)在識(shí)別出引入的錯(cuò)配之后通過(guò)內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制的激活進(jìn)行。形成三聯(lián)體的寡核苷酸也已經(jīng)被用作基因靶向的序列特異性工具。形成三聯(lián)體的寡核苷酸在雙鏈體DNA的大溝中以高親和力結(jié)合。由于該特性，已經(jīng)提出將形成三聯(lián)體的寡核苷酸作為位點(diǎn)特異性修正靶向基因的工具(Knauert等人,HumMolGenet.(2001)10,2243-2251；Richardson等人,DrugTarget(2002)10,133-134；Thoung等人,(1993)AngewandteChemie.Intl.Ed.Eng.,32,666-690.)。目前的靶向基因修復(fù)方法不是非常有效，而且/或者尚未證實(shí)在活細(xì)胞中原位發(fā)揮作用，為修復(fù)基因缺陷的其他機(jī)制留下空間。RNA水平上缺陷基因的修復(fù)已見(jiàn)諸報(bào)道。例如，采用通過(guò)雙鏈寡核苷酸復(fù)合物的mRNA特定修復(fù)在體外在ΔF508CFTRmRNA中插入核苷酸。介導(dǎo)該過(guò)程的機(jī)制假定是RNA酶H介導(dǎo)的降解，然后是RNA修復(fù)(PCZamecnik,MKRaychowdhury,DRTabatadze,HFCantielloReversalofcysticfibrosisphenotypeinaculturedΔF508cysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorcelllinebyoligonucleotideinsertion(通過(guò)寡核苷酸插入在培養(yǎng)的ΔF508囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子細(xì)胞系中逆轉(zhuǎn)囊性纖維化表型),ProcNatlAcadSci2004101(21)8150-8155；WO2005094370,oligonucleotidecomplexcompositionsandmethodsofuseasgenealterationtools(寡核苷酸復(fù)合物組合物及其用作基因變更工具的方法))。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)涉及用于活細(xì)胞中的靶向基因修復(fù)的方法，更優(yōu)選地，在多細(xì)胞有機(jī)體中(在體內(nèi))在活細(xì)胞中的靶向基因修復(fù)的方法。更具體地，本專(zhuān)利技術(shù)涉及在多細(xì)胞有機(jī)體中、更具體地在動(dòng)物中、更具體地在哺乳動(dòng)物中、再更具體地在人中在體內(nèi)改變活細(xì)胞中的目標(biāo)RNA。盡管有更早的活細(xì)胞中基因修復(fù)的報(bào)道，但據(jù)信本專(zhuān)利技術(shù)首次公開(kāi)了使用寡核苷酸、優(yōu)選單鏈寡核苷酸、更優(yōu)選單鏈寡核糖核苷酸、再更具體地為化學(xué)修飾的單鏈寡核糖核苷酸在體內(nèi)改變活細(xì)胞中的目標(biāo)RNA分子、從而改變?cè)撚袡C(jī)體的表型的可能性。出人意料地，根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的寡核苷酸可以以基本上恢復(fù)受試者有機(jī)體患病表型的量在體內(nèi)不喪失活性地進(jìn)行給藥。本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)如下示例：將能夠恢復(fù)編碼CFTR的RNA序列、從而恢復(fù)CFTR蛋白質(zhì)功能并恢復(fù)CF表型或者至少減輕有機(jī)體病情的經(jīng)化學(xué)修飾的寡核糖核苷酸給予患有囊性纖維化的有機(jī)體的肺中。因此，本專(zhuān)利技術(shù)涉及寡核苷酸，優(yōu)選為單鏈反義寡核苷酸；包括該寡核苷酸的組合物；包括該寡核苷酸和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物；該寡核苷酸或組合物用于在體內(nèi)或體外進(jìn)行RNA修復(fù)和/或改變目標(biāo)RNA分子的序列的用途和方法；該寡核苷酸或組合物用于與(遺傳)病有關(guān)或與基因突變有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防，包括將該寡核苷酸或組合物給予受試者、優(yōu)選人受試者；以及包括將該寡核苷酸或組合物給予受試者、優(yōu)選人受試者的用于治療或預(yù)防與(遺傳)病有關(guān)或與基因突變有關(guān)的疾病的方法。在將該優(yōu)選為單鏈反義的寡核苷酸引入到細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞、更優(yōu)選人細(xì)胞中時(shí)，將其在RNA需要被修復(fù)、并有可能起到RNA修復(fù)的指導(dǎo)鏈作用的位置處引向RNA或其前體或其模板。具體的修復(fù)機(jī)制尚未知曉，但根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的優(yōu)選為單鏈修復(fù)分子的寡核苷酸優(yōu)選在修復(fù)過(guò)程中不允許RNA酶H發(fā)揮作用。在目標(biāo)RNA中介導(dǎo)的變化可以直接體現(xiàn)在RNA水平上或者經(jīng)由隨后轉(zhuǎn)錄成RNA分子的DNA或其前體間接體現(xiàn)。在此所述的寡核苷酸通常稱(chēng)作本專(zhuān)利技術(shù)的寡核苷酸，并可以用于本專(zhuān)利技術(shù)的所有實(shí)施方式中。本專(zhuān)利技術(shù)的所有實(shí)施方式均可以在體外、在體內(nèi)或離體進(jìn)行(在方法或用途的情況下)或使用(在化合物或組合物的情況下)。本專(zhuān)利技術(shù)可以方便地用于治療囊性纖維化，優(yōu)選地通過(guò)修復(fù)CFTR(囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子)外顯子10中的ΔF508突變。根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的一示例性寡核苷酸——SEQIDNO:1所示分子的作用方式描繪于圖1-3和7A中。根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的一示例性寡核苷酸——SEQIDNO:1所示分子相比較于之前所述的雙鏈體(Zamecnik等人，同上)的活性描繪于圖4中。附圖表明，與之前所述的雙鏈體分子相比較，當(dāng)前所述的單鏈反義寡核苷酸(AON)在修復(fù)CFTR方面至少具有相同的活性，并且似乎活性更強(qiáng)(PCZamecnik,MKRaychowdhury,DRTabatadze,HFCantielloReversalofcysticfibrosisphenotypeinaculturedΔF508cysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorcelllinebyoligonucleotideinsertion(通過(guò)寡核苷酸插入在培養(yǎng)的ΔF508囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子細(xì)胞系中逆轉(zhuǎn)囊性纖維化表型),ProcNatlAcadSci2004101(21)8150-8155；WO2005094370,oligonucleotidecomplexcompositionsandmethodsofuseasgenealterationtools(寡核苷酸復(fù)合物組合物及其用作基因變更工具的方法))。SEQIDNO:1的活性使用Zamecnik等人在同上文獻(xiàn)中所述的比較試驗(yàn)測(cè)定，尤其是參見(jiàn)第8153頁(yè)圖4。本專(zhuān)利技術(shù)還可以方便地用于改變其他目標(biāo)RNA分子和/或治療與(遺傳)病相關(guān)的其他疾病，例如但不限于，白化病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、阿爾茨海默氏癥、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、哮喘、β-地中海貧血、Cadasil綜合征(Cadasilsyndrome)、腓骨肌萎縮癥、慢本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種寡核苷酸用于改變活細(xì)胞中存在的目標(biāo)RNA分子的序列的用途，其包括以下步驟：在使得活細(xì)胞能攝取所述寡核苷酸的條件下對(duì)所述活細(xì)胞提供所述寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括與所述目標(biāo)RNA分子至少部分互補(bǔ)的序列，使得在所述活細(xì)胞中發(fā)生寡核苷酸與目標(biāo)RNA或其前體或其模板的雜交，使所述活細(xì)胞中存在的生化機(jī)制將寡核苷酸序列中相對(duì)于目標(biāo)RNA分子序列的差異直接地或經(jīng)由其前體或其模板拷貝到RNA分子上，以引起所述目標(biāo)RNA的序列變化。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】2013.05.03 EP 13166465.8;2013.06.18 EP 13172515.2;1.一種用于治療人體或動(dòng)物體中的囊性纖維化的單鏈寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷均為2’-O烷基核糖核苷，其中通過(guò)在使得活細(xì)胞能攝取所述寡核苷酸的條件下對(duì)所述活細(xì)胞提供所述寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠改變所述人體或動(dòng)物體的活細(xì)胞中存在的目標(biāo)RNA分子的序列，其中所述寡核苷酸包括與所述目標(biāo)RNA分子至少部分互補(bǔ)的序列，使得在所述活細(xì)胞中發(fā)生寡核苷酸與目標(biāo)RNA或其前體或其模板的雜交，使所述活細(xì)胞中存在的生化機(jī)制將寡核苷酸序列中相對(duì)于目標(biāo)RNA分子的差異直接地或經(jīng)由其前體或其模板拷貝到RNA分子上，以引起所述目標(biāo)RNA的變化，其中：所述寡核苷酸由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸1-33組成，并且其中所述目標(biāo)RNA是CFTRRNA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中(a)：所述目標(biāo)RNA的序列變化導(dǎo)致細(xì)胞改變其表型；(b)其中所述目標(biāo)RNA的序列的變化通過(guò)測(cè)定所述目標(biāo)RNA或其前體或其模板的序列而證實(shí)；(c)其中所述目標(biāo)RNA的序列的變化通過(guò)測(cè)定由所述目標(biāo)RNA編碼的多肽產(chǎn)物的序列而證實(shí)；(d)其中所述目標(biāo)RNA的序列的變化通過(guò)測(cè)定所述活細(xì)胞或包括所述細(xì)胞的有機(jī)體中的表型變化而證實(shí)，理想地，其中所述表型變化是與變化之前目標(biāo)RNA的序列有因果關(guān)系的疾病的減輕。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核糖核苷酸包括肌苷，并且/或者包括修飾。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其中所述修飾的核苷酸選自5-甲基-dC、2-氨基-dA、C5-嘧啶，和/或選自硫代磷酸酯鍵和甲基膦酸酯鍵的修飾的核苷間的鍵。5.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的全部核苷均為2’-O-甲基核糖核苷。6.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在載體中提供，并且/或者其中所述寡核苷酸與遞送化合物復(fù)合，并且/或者與甾醇連接。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的寡核苷酸，其中所述載體為脂質(zhì)體、多核糖體或納米顆粒。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的寡核苷酸，其中所述遞送化合物為聚乙烯-亞胺(PEI)或聚乙二醇(PEG)。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的寡核苷酸，其中所述甾醇為膽固醇。10.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸以干燥制劑或以氣溶膠的形式提供給呼吸道或肺。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸經(jīng)由氣道提供給呼吸道或肺。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸以干燥制劑或以氣溶膠的形式使用噴霧器提供給呼吸道或肺。13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與轉(zhuǎn)染介質(zhì)和/或囊性纖維化藥物和/或用于治療CF的小分子一起提供。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的寡核苷酸，其中所述囊性纖維化藥物為DNA酶或甘露醇。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的寡核苷酸，其中所述甘露醇是Bronchitol。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的寡核苷酸，其中所述用于治療CF的小分子是Kalydeco(ivacaftor；VX-770)、VX-809(Lu...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·A·德布爾，T·里策馬，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：PROQR治療上市公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：荷蘭;NL