一種用于再生處理細胞和病毒培養用微載體的方法技術

本發明專利技術涉及一種細胞及病毒培養用微載體的再生處理方法。該方法是通過特殊處理液和合適的處理手段對已使用過的微載體即已培養過貼壁細胞的微載體進行有效的處理，使其達到與新微載體一樣的培養效果。并且通過本方法處理，可使微載體反復使用4至5次，即便是第5次使用處理過的微載體，其細胞及病毒培養效果仍達到新微載體的90%以上的培養效果。所以本方法的建立不僅使微載體的利用率提高了近4倍，也使規模利用微載體培養細胞和病毒的成本得到了大幅度的降低。本發明專利技術所述的微載體再生處理方法可廣泛用于處理在細胞培養中使用的其它微載體。

【技術實現步驟摘要】
一種用于再生處理細胞和病毒培養用微載體的方法
本專利技術涉及一種細胞及病毒培養用微載體的再生處理方法，其屬于生物

技術介紹
上個世紀60年代以來，隨著細胞生物學、培養系統以及培養方法等領域的不斷豐富和完善，動物細胞體外培養技術得到了突飛猛進地發展，現已成為生物醫藥和醫學研究中廣泛采用的技術方法。目前，利用動物細胞培養技術生產出很多具有重要醫用價值的疫苗、單抗、細胞因子、蛋白類藥物和酶類物質。毋庸置疑，動物細胞大規模培養技術已成為了生物技術制藥中非常重要的環節。而微載體作為細胞領域絕大多數的貼壁動物細胞貼壁介質，其質量的優劣會直接影響細胞的生長，甚至可以影響以細胞為宿主的病毒的增殖。因此，大規模動物細胞培養技術中，經常把生物反應器和微載體一起稱為生物反應器微載體培養系統，可見二者在規模化培養過程中的密切關系和重要性。作為細胞培養介質，早在1967年，VanWezel為貼壁依賴性細胞的高產培養就已提出“微載體”培養系統的概念。經過以后幾十年，尤其是生物反應器在細菌發酵罐控制模式基礎上的升級換代，微載體培養技術現已廣泛地應用于動物細胞的大規模體外培養。但是，由于我國在微載體制造技術上還不成熟，微載體來源還只能依賴于國外進口。進口的微載體由于技術的壟斷，其價格昂貴，致使大規模的細胞或病毒培養工藝中，微載體的成本占據了大部分研發和生產成本，無形中給國內生物制藥技術的發展造成了很大影響。為了降低這部分成本，以及避免在大規模細胞或病毒培養過程中意外原因造成培養終止而使微載體沒有充分利用而廢棄。許多利用微載體大規模培養細胞或病毒來開發和生產生物醫藥的企業，對使用過的微載體進行了重復處理方法的摸索與建立(如申請號201210075589.2專利，以及文獻《微載體再生的研究》(作者：李志強、王妍、官桂范、李云富等，發表于《中國生物制品學雜志》1994年第7第3期))，但對于采用這些方法處理再生的微載體，尚未在細胞培養效果或病毒培養效果方面進行評估。其中，對于微載體處理效果的好壞，不僅要評估處理后的微載體表面是否干凈，不貼附異物，更重要的是評估該微載體再生處理后在培養細胞或病毒過程中的培養效果好壞。因此，本領域還需要提供新的微載體再生處理方法，并且提供評估該方法再生處理得到的微載體是否能夠保證細胞和病毒正常、良好的培養應用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服上述的技術的不足，而提供一種細胞及病毒培養用微載體再生處理方法，該方法使處理后的微載體培養效果可達到新使用的微載體細胞及病毒培養效果的95％-100％。并且采用這種再生處理方法，最少可以使微載體反復使用4-5次，第5次使用時，細胞或病毒培養效果仍為第1次使用的新微載體培養效果的90％-95％。本專利技術的目的通過以下技術方案得以實現：本專利技術提供的一種用于再生處理微載體的方法包括以下步驟：1)微載體收集：用硅化好的玻璃瓶收集含細胞和/或培養過的微載體的培養液，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液，保留微載體在玻璃瓶中；2)微載體堿處理：向經沉降得到的微載體中加入氫氧化鈉溶液，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.1-1.0mol/L，微載體與加入的氫氧化鈉溶液的體積比為1:1-1:2，搖動3-5分鐘后，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液；3)微載體的第一次洗滌：向經沉降得到的微載體中加入洗滌液Ⅰ，所述洗滌液I為含有0.01％-0.05％聚山梨酯80的10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸鹽緩沖液，微載體與加入的洗滌液I的體積比為1:2-1:3，搖動3-5分鐘后，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液，并重復此項操作2次；4)微載體消化液處理：向經沉降得到的微載體中加入消化液，所述消化液以質量百分比含量計包含0.2％-0.4％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二鈉、0.85％氯化鈉、0.01％-0.05％聚山梨酯80，微載體與加入的消化液的體積比為1:1-1:2，搖動3-5分鐘后，自然沉降20-40分鐘，棄掉上清液；5)微載體酸處理：向經沉降得到的微載體中加入檸檬酸溶液，所述檸檬酸溶液的濃度為0.05-0.1mol/L，微載體與檸檬酸溶液的體積比為1:1，搖動3-5分鐘后，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液；6)微載體第二次洗滌：向經沉降得到的微載體中加入洗滌液Ⅱ，所述洗滌液Ⅱ為10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸鹽緩沖液，微載體與洗滌液Ⅱ的體積比為1:2-1:3，搖動3-5分鐘后，自然沉降20-40分鐘，棄掉上清液，重復此項操作2-3次。并且，根據實際應用，所述方法還包括：7)取處理好的微載體樣品在顯微鏡下觀察及pH值測定；和/或8)處理好的微載體滅菌處理：將微載體進行121℃高壓滅菌15-45分鐘，室溫自然冷卻后，置于2-8℃的情況下保存備用。在本專利技術的優選技術方案中，上述步驟中用到的氫氧化鈉溶液濃度為0.5mol/L。優選地，所述洗滌液Ⅰ為含有0.05％聚山梨酯80的10mmol/L、pH值7.6磷酸鹽緩沖液。優選地，所述消化液中各成分的質量百分比為胰蛋白酶0.2％、乙二胺四乙酸二鈉0.02％、氯化鈉0.85％、聚山梨酯800.05％。優選地，所述檸檬酸溶液的濃度為0.08mol/L。優選地，所述洗滌液Ⅱ為20mmol/L，pH值7.5磷酸鹽緩沖液。優選地，所述步驟7)包括：在顯微鏡下觀察5-10個視野，所看到的微載體表面均無細胞殘骸。最終得到的微載體懸液pH值為7.0-7.8。以下是本專利技術的詳細描述。本專利技術所述的一種微載體再生處理方法，包括以下步驟：1.微載體收集：使用硅化好的玻璃瓶收集用于細胞和/或病毒培養過的微載體和培養液，自然沉降15-30分種，使微載體沉淀下來，棄掉上清液；2.微載體的堿處理：按照上述沉淀與氫氧化鈉溶液體積比1:1-1:2，加入0.1-1.0mol/L氫氧化鈉溶液，搖動3-5分種，使微載體在溶液中呈均勻懸濁液，然后，微載體懸濁液自然沉降15-30分種，使微載體沉淀下來，棄掉上清液；3.微載體的第一次洗滌：按照微載體和洗滌液Ⅰ(10-30mmol/L，pH值7.4-7.8磷酸鹽緩沖液，含有0.01％-0.05％聚山梨酯80)體積比1:2-1:3加入洗滌液I，搖動3-5分種，使微載體在溶液中呈均勻懸濁液，然后，微載體懸濁液自然沉降15-30分種，使微載體沉淀下來，棄掉上清液，重復操作此步驟2次；4.微載體的消化液處理：按照微載體與消化液體積比為1:1-1:2，加入質量百分比含量為0.2％-0.4％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二鈉(簡稱EDTA二鈉)、0.85％氯化鈉(簡稱NaCl)、0.01％-0.05％聚山梨酯80的消化液。搖動3-5分種，使微載體與消化液混合成均勻的懸濁液，然后，室溫下靜止，自然沉降20-40分種，棄掉上清液；5.微載體的酸處理：按照微載體與檸檬酸溶液體積比1:1，加入0.05-0.1mol/L檸檬酸溶液，搖動3-5分種，使微載體在溶液中呈均勻懸濁液，然后，微載體懸濁液自然沉降15-30分種，使微載體沉淀下來，棄掉上清液；6.微載體的第二次洗滌：按照微載體懸液和洗滌液Ⅱ體積比1:2-1:3，加入洗滌液Ⅱ(10-30mmol/L，pH值7.4-7.8磷酸鹽緩沖液)，搖動3-5分種，使微載體在溶液中呈均勻懸濁本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于再生處理微載體的方法，所述方法包括以下步驟：1）微載體收集：用硅化好的玻璃瓶收集含細胞和/或培養用過的微載體的培養液，自然沉降15?30分鐘，棄掉上清液，保留微載體在玻璃瓶中；2）微載體堿處理：向經沉降得到的微載體中加入氫氧化鈉溶液，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.1?1.0mol/L，微載體與加入的氫氧化鈉溶液的體積比為1:1?1:2，搖動3?5分鐘后，自然沉降15?30分鐘，棄掉上清液；3）微載體的第一次洗滌：向經沉降得到的微載體中加入洗滌液Ⅰ，所述洗滌液Ⅰ為含有0.01%?0.05%聚山梨酯80的10?30mmol/L、pH值7.4?7.8磷酸鹽緩沖液，微載體與加入的洗滌液I的體積比為1:2?1:3，搖動3?5分鐘后，自然沉降15?30分鐘，棄掉上清液，并重復此項操作2次；4）微載體消化液處理：向經沉降得到的微載體中加入消化液，所述消化液以質量百分比含量計包含0.2%?0.4%胰蛋白酶、0.02%二乙胺四乙酸二鈉、0.85%氯化鈉、0.01%?0.05%聚山梨酯80，微載體與加入的消化液的體積比為1:1?1:2，搖動3?5分鐘后，自然沉降20?40分鐘，棄掉上清液；5）微載體酸處理：向經沉降得到的微載體中加入檸檬酸溶液，所述檸檬酸溶液的濃度為0.05?0.1mol/L，微載體與檸檬酸溶液的體積比為1:1，搖動3?5分鐘后，自然沉降15?30分鐘，棄掉上清液；6）微載體第二次洗滌：向經沉降得到的微載體中加入洗滌液Ⅱ，所述洗滌液Ⅱ為10?30mmol/L、pH值7.4?7.8磷酸鹽緩沖液，微載體與洗滌液Ⅱ的體積比為1:2?1:3，搖動3?5分鐘后，自然沉降20?40分鐘，棄掉上清液，重復此項操作2?3次。...

【技術特征摘要】
1.一種用于再生處理微載體的方法，所述方法由按以下順序進行的步驟組成：1)微載體收集：用硅化好的玻璃瓶收集含培養用過的微載體的培養液，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液，保留微載體在玻璃瓶中；2)微載體堿處理：向經沉降得到的微載體中加入氫氧化鈉溶液，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.1-1.0mol/L，微載體與加入的氫氧化鈉溶液的體積比為1:1-1:2，搖動3-5分鐘后，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液；3)微載體的第一次洗滌：向經沉降得到的微載體中加入洗滌液Ⅰ，所述洗滌液Ⅰ為含有0.01％-0.05％聚山梨酯80的10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸鹽緩沖液，微載體與加入的洗滌液I的體積比為1:2-1:3，搖動3-5分鐘后，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液，并重復此項操作2次；4)微載體消化液處理：向經沉降得到的微載體中加入消化液，所述消化液以質量百分比含量計包含0.2％-0.4％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二鈉、0.85％氯化鈉、0.01％-0.05％聚山梨酯80，微載體與加入的消化液的體積比為1:1-1:2，搖動3-5分鐘后，自然沉降20-40分鐘，棄掉上清液；5)微載體酸處理：向經沉降得到的微載體中加入檸檬酸溶液，所述檸檬酸溶液的濃度為0.05-0.1mol/L，微載體與檸檬酸溶液的體積比為1:1，搖動3-5分鐘后，自然沉降15-30分鐘，棄掉上清液；6)微載體第二次洗滌：向經沉降得到的微載體中加入...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李云富，李剛，吳林彝，黃奕斌，郭曉娜，羅翀，肖俊光，
申請(專利權)人：麗珠集團疫苗工程股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44