一種系統性紅斑狼瘡的診斷標志技術方案

本發明專利技術涉及一種系統性紅斑狼瘡的診斷標志，具體公開了一種特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑在制備用于系統性紅斑狼瘡的診斷和/或預后評估的診斷工具中的應用。所述血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的增高與系統性紅斑狼瘡的發生密切相關，可用于系統性紅斑狼瘡的早期診斷和/或預后評估，進而用于指導系統性紅斑狼瘡的治療。

【技術實現步驟摘要】
一種系統性紅斑狼瘡的診斷標志
本專利技術涉及疾病的診斷
，尤其涉及一種系統性紅斑狼瘡的診斷標志及其應用。
技術介紹
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種彌漫性、全身性自身免疫病。它有多種臨床癥狀，會牽涉到皮膚粘膜、骨骼肌肉、腎臟及中樞神經系統性疾病，有時還會引發肺、心臟等多個其他器官和系統功能紊亂，SLE好發于青年女性，發病高峰為15～40歲，男女發病比例為1：9左右，盡管研究發現其發病有一定的家庭聚集傾向，但是其發病機制并非單一的遺傳因素。目前系統性紅斑狼瘡的發病機制尚不明確。研究發現，在系統性紅斑狼瘡患者的血清中，可檢測到多種自身抗體和免疫學異常。目前對于系統性紅斑狼瘡的檢測也通常借助于一些輔助檢查，如常規檢查中的血常規、尿常規等以及免疫系統的檢查和自身抗體的檢查可以做出診斷。目前參照的標準仍然是1997年美國風濕病學會修訂的的系統性紅斑狼瘡分類標準。但是，該標準對早期、不典型病例容易漏診，因此繼續發現一種新的診斷標志物來作為這種疾病早期診斷和后期治療的指導。蛋白質糖基化修飾是一種最普遍和最多變的翻譯后修飾，是特異糖鏈在細胞內質網中添加到蛋白質上形成寡糖鏈的過程，具有酶定向和位點特異性。根據與蛋白質部分連接方式的不同，蛋白質糖基化修飾分為N-糖基化和O-糖基化兩種形式。N-糖鏈一般分為高甘露糖型、復雜型和雜合型三種。多年來，人們已對多種蛋白的糖基化修飾進行了廣泛深入的研究，并清楚地認識到蛋白糖基化修飾在很多疾病的發生發展中扮演著重要角色，例如肝細胞癌中甲胎蛋白的高巖藻糖基化等。免疫球蛋白是可溶性血清糖蛋白，可為高等脊椎動物提供針對已暴露抗原的長期保護。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白種類，占人血清免疫球蛋白的80%，是再次免疫應答后形成抗體的主要組分，在機體中發揮重要作用。糖基化在免疫球蛋白的結構和功能中扮演著重要角色。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提出血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平可作為系統性紅斑狼瘡（SLE）的診斷標志，并具體提出用于特異性檢測該診斷標志物的試劑在制備用于系統性紅斑狼瘡的診斷和/或預后評估的診斷工具中的應用；本專利技術所提出的系統性紅斑狼瘡的診斷標志的水平與系統性紅斑狼瘡的發生密切相關，可用于系統性紅斑狼瘡的早期診斷和/或預后評估，進而用于指導系統性紅斑狼瘡的治療。具體地，一方面，本專利技術提供了一種特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑在制備用于系統性紅斑狼瘡的診斷和/或預后評估的診斷工具中的應用。上述應用中，作為優選，所述血清抗體為血清IgG型抗體。作為優選，所述高甘露糖型N糖鏈為結構式分別如I、II和III所示糖鏈的任意一種或幾種的混合物；其中，結構式I為：Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man-Man)Man-Man-Man；結構式II為：Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man)2(Man)2GlcNAc(Man)3(Man)2；結構式III為：Asn-GlcNAc(Fuc)-GlcNAc-Man-(Man)4(GlcNAc-Gal)(Man-GlcNAc-Gal)。上述結構式中，Asn表示天冬氨酸，GlcNAc表示葡萄糖胺，Man表示甘露糖，Gal表示半乳糖，Fuc表示巖藻糖。作為優選，通過免疫測定法檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈的水平；優選地，所述免疫測定法為酶免疫測定法、免疫比濁測定法、乳膠免疫凝集法、電化學發光法或熒光法；更優選地，所述免疫測定法為酶聯免疫吸附測定法。作為優選，所述特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑包括特異性識別高甘露糖型N糖鏈的抗體或配體。更優選地，所述抗體為單克隆抗體或抗原結合片段；最優選地，所述抗體為鼠抗人單克隆抗體。所述診斷工具為診斷試劑、試劑盒、蛋白芯片或免疫檢測試紙。作為優選，通過質譜法檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈的相對豐度；這種糖鏈的鑒定方法需要借助質譜儀。上述應用中，通過檢測待測個體的血清抗體中高甘露糖型N糖鏈的水平，將其與相同檢測條件下的正常個體的血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平相比的增高，診斷為患有系統性紅斑狼瘡。另一方面，本專利技術提供了一種系統性紅斑狼瘡的診斷工具，該診斷工具包括特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑；優選地，所述診斷工具為診斷試劑、試劑盒、蛋白芯片或免疫檢測試紙；優選地，所述特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑為特異性識別高甘露糖型N糖鏈的抗體或配體。本專利技術專利技術人基于這樣一個發現，即血清抗體中高甘露糖型N糖鏈的高水平與系統性紅斑狼瘡的發生有關，提出了血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平可作為系統性紅斑狼瘡的診斷標志，用于系統性紅斑狼瘡的早期診斷和/或預后評估，進而用于指導系統性紅斑狼瘡的治療。附圖說明圖1是質譜檢測正常個體和SLE病人血清抗體的N糖鏈；其中，A為正常個體血清抗體N糖鏈的一級質譜圖，B為SLE病人血清抗體的N糖鏈一級質譜圖。圖2是圖1中m/z909.5峰所對應的糖鏈的二級質譜分析圖。圖3是實施例1中所述三種高甘露糖型N糖鏈在10個SLE病人和10個正常對照的相對豐度比較；**表示p<0.001，***表示p<0.005。圖4是質譜檢測正常小鼠和SLE小鼠血清抗體的N糖鏈；其中，A為正常小鼠血清抗體N糖鏈的一級質譜圖，B為SLE小鼠血清抗體N糖鏈的一級質譜圖。具體實施方式下面通過具體實施例來進一步說明本專利技術的技術方案，這些實施例僅用于說明的目的，而不以任何方式限制本專利技術的范圍。實施例1使用PNGaseF酶試劑盒（IBL，德國），按照廠商提供的試劑盒說明書，提取血清抗體N糖鏈，并對血清抗體N糖鏈進行一級及多級質譜分析，其過程如下：（1）收集SLE病人血清樣本，2000r/min離心10min。（2）取上清，以1mL血清加入3mLPBS緩沖液的比例進行稀釋，逐滴加入飽和硫酸銨緩沖液，靜置3h后，6000r/min離心。（3）將步驟（2）獲得的沉淀進一步經過sephadexG25脫鹽，然后經過proteinG柱子進一步純化抗體，冷凍干燥得血清抗體，并保存于-20℃備用。（4）取500微克血清抗體置于離心管中，加入5微升10×變性劑、45微升超純水，混勻，再煮沸10min，然后離心。（5）冷卻至室溫，加入5微升10×G7緩沖液、5微升10%NP-40緩沖液，加入1微升PNGaseF酶，于37℃下過夜。（6）然后干燥樣品，過SEP-C18柱。樣品進一步經過真空干燥以后，冰浴下加入300微升新鮮配制的還原溶液——NaBH4溶液（10mg/mlin0.01NNaCl），室溫下靜置過夜。（7）冰浴下，加入幾滴乙酸終止反應，然后升溫至室溫，并加入3ml乙醇干燥樣品。（8）為了去除樣品中的硼酸鹽，分別、依次向上述干燥的樣品中加入3ml下列試劑：a、1%乙酸：甲醇，b、甲苯，c、1%乙酸：甲醇，d、甲苯，e、1%乙酸：甲醇，重復進行加入試劑-干燥的步驟，最終得到的干燥樣品即為從血清抗體中切割下來的糖鏈。（9）用1ml水溶解切割下來的糖鏈。（10）準備PGC預裝柱（需要親和層析裝置），分別、依次向預裝柱中加入下列試劑3ml：a）1MNaOH；b）HPLC水；c）80%ACN水溶液（內含0.1%TFA；d）25%ACN水溶液（內含0.05%TFA；e本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑在制備用于系統性紅斑狼瘡的診斷和/或預后評估的診斷工具中的應用。

【技術特征摘要】
1.一種特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑在制備用于系統性紅斑狼瘡的診斷和/或預后評估的診斷工具中的應用；所述高甘露糖型N糖鏈為結構式分別如I、II和III所示糖鏈的任意一種或幾種的混合物；其中，結構式I為：Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man-Man)Man-Man-Man；結構式II為：Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man)2(Man)2GlcNAc(Man)3(Man)2；結構式III為：Asn-GlcNAc(Fuc)-GlcNAc-Man-(Man)4(GlcNAc-Gal)(Man-GlcNAc-Gal)。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述血清抗體為血清IgG型抗體。3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，通過免疫測定法檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈的水平。4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述免疫測定法為酶免疫測定法、免疫比濁測定法、乳膠免疫凝集法、電化學發光法或熒光法。5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述免疫測定法為酶聯免疫吸附測定法。6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑包括特異性識別高甘露糖型N糖鏈的抗體或配體。7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體或抗原結合片段。8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述抗體為...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳忠福，李云森，
申請(專利權)人：蘇州中贏醫療科技有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32