一種交聯抗體及其在免疫檢測中應用制造技術

本發明專利技術提供一種交聯抗體，所述抗體包括由非人的TORCH病原體抗體和健康的未感染TORCH病原體的人抗體所形成的四聚體，本發明專利技術還提供了交聯抗體作為替代病人陽性血液的質控品在免疫檢測試劑盒中的應用。所述異源交聯物生產制備簡單、成本低，同時具有非常好的安全性和穩定性，可有效降低檢測誤差。

【技術實現步驟摘要】
一種交聯抗體及其在免疫檢測中應用本申請是申請號為201310267573.6、申請日2013年6月28日的中國專利申請的分案申請。
本專利技術涉及一種異源交聯物，具體而言就是一種由兩種異源的抗體通過交聯反應而獲得的含有四聚體形式的異源交聯抗體的異源交聯物，及其在病人陽性血液中病原體抗體替代物上的應用，屬于免疫學

技術介紹
如今，諸如病毒、細菌、真菌和寄生蟲之類的病原體給人類帶來的威脅越來越大。基于抗原和抗體之間特異性和高靈敏性反應的免疫分析方法，如膠體金免疫層析檢測、乳膠免疫層析檢測、放射免疫檢測(RIA)、酶聯免疫吸附檢測(ELISA)、時間分辨熒光免疫檢測(TRFIA)或化學發光免疫檢測(CLIA)，已經被廣泛地用于臨床免疫測試之中。這些免疫分析方法通常被用來定性或定量地檢測人血液中的病原體抗原或抗體，從而快速和準確地確定感染是否發生和/或感染所處的階段。臨床免疫檢測試劑盒一般都包括陰性質控品和陽性質控品。這些質控品往往來自抗體效價較高的病人陽性血液的系列稀釋品，或者直接使用不同抗體效價的病人陽性血液，包括血清、血漿或全血。但是利用病人陽性血液制備陽性質控品有很多缺點：1)很難獲得同時具有高效價和高特異性的病人陽性血液；2)個體之間的抗體效價和特異性差異較大，難以標準化；3)成本比較高，4)有些病原體感染病例稀缺，在短時間內很難獲得足夠的陽性血液；5)病原體陽性血液具有潛在的傳染性，即便經過滅活處理，但仍然難以保證徹底滅活，同時在收集和滅活病人陽性血液時，操作人員也有潛在被感染的風險。為此，人們經常使用替代病人陽性血液的質控品。歐洲專利申請EP0330902A2揭示出在檢測人血液特異性抗體時，使用一種或多種人單克隆抗體(如人抗風疹病毒單克隆抗體和人抗水痘帶狀皰疹病毒單克隆抗體)作為測試對照，但是每次構建的人單克隆抗體只包括一種抗體的恒定區，檢測其他抗體類型需要重新構建，而且由于在倫理上不允許利用人體進行抗體制備，因而不得不利用噬菌體展示技術和轉基因動物等方法來制造人單克隆抗體，這就使得抗體制備比較困難。美國專利US6,015,662揭示出人鼠嵌合抗體可以用于人血液抗體檢測的陽性對照，但是每次構建的人鼠嵌合單克隆抗體只包括一種抗體的恒定區，檢測其他抗體類型需要重新構建，而且工藝非常復雜，這是因為除了利用雜交瘤技術獲得小鼠單克隆抗體之外，還要進行抗體基因克隆以及人鼠嵌合基因的構建和表達。目前除上述方法制備抗體外，還出現了利用交聯劑制備抗體。已有很多種利用交聯劑制備交聯抗體的方法。如交聯劑琥珀酰亞胺吡啶二巰基丙酯[N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP]可被用來將兩種不同的蛋白(包括抗體和酶)交聯在一起而形成交聯物(CarlssonJ,DrevinH,andAxénR.Proteinthiolationandreversibleprotein-proteinconjugation.N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate,anewheterobifunctionalreagent.Biochem.J.,1978,173:723-737)。交聯劑苯二馬來酰亞胺(O-phenylenedi-maleimide,O-PDM)也被用來將兩種抗體的片段交聯在一起(GlennieM,McBrideH,WorthA,etal..PreparationandperformanceofbispecificF(ab'gamma)2antibodycontainingthioether-linkedFab'gammafragments.J.Immunol.,1987,139:2367-2375)。歐洲專利EP0062227A1揭示出利用交聯劑戊二醛或高碘酸鈉將兩種不同物種來源的抗體偶聯在一起。此外，美國專利US4,507,234揭示了交聯劑二硫代雙硝基苯甲酸[5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoicacid),DTNB]可被用來制備交聯抗體。美國專利US4,929,543揭示了交聯劑S-乙酰巰基丁二酸酐(S-acetylmercaptosuccinicanhydride,AMSA)和馬來酰亞胺己酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimideester,MHS)可被用來制備交聯抗體。美國專利US5,478,753揭示了交聯劑4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯(N-γ-maleimidobutyryloxysuccinimideester,GMBS)可被用來制備交聯抗體。交聯抗體也常被用于制備替代病人陽性血液的質控品。美國專利US4,929,543揭示了非人的抗體或其Fab或F(ab')2片段和人免疫球蛋白或其Fc片段的異源交聯物，用于人血清抗體診斷。美國專利US5,478,753揭示了非人的非IgM和人IgM的異源交聯物，用于血清IgM診斷試劑盒，異源交聯物中的非人的非IgM可特異性地識別和結合病原體抗原，人IgM可以和標記抗體結合。美國專利US5,491,218揭示了非人的抗體或其片段和另一種抗體的異源交聯物，如人IgM和抗單純皰疹病毒抗體F(ab')2片段的異源交聯物，異源交聯物中非人的抗體特異性地結合一種特定的病原體，另一種抗體特異性地結合一種特定的抗體類型。中國專利ZL97109106.4揭示了非人的抗艾滋病病毒抗體或經處理后具有抗體活性的片段和人免疫球蛋白的異源交聯物，可用作病人陽性血液中艾滋病病毒抗體的替代物。但是以上這些專利中并沒有揭示制備出的異源交聯物的具體組成，這就造成了異源交聯物不同批次之間質量不穩定，容易產生檢測誤差，替代性較差。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種由兩種異源的抗體通過交聯反應而獲得的異源交聯物，所述異源交聯物包括由所述兩種異源的抗體形成的四聚體形式的異源交聯抗體。優選地，所述兩種異源的抗體為非人的病原體抗體和健康的未感染病原體的人抗體；優選地，所述四聚體形式的異源交聯抗體在所述異源交聯物中所占的質量比不小于50％。本專利技術的目的在于一種異源交聯物在病人陽性血液中病原體抗體替代物上的應用，所述異源交聯物是由兩種異源的抗體通過交聯反應而獲得的，所述異源交聯物包括由所述兩種異源的抗體形成的四聚體形式的異源交聯抗體。優選地，所述兩種異源的抗體為非人的病原體抗體和健康的未感染病原體的人抗體；優選地，所述四聚體形式的異源交聯抗體在所述異源交聯物中所占的質量比不小于50％。本專利技術的另一個目的在于提供一種替代病人陽性血液的質控品，所述質控品包括稀釋液和一種由兩種異源的抗體通過交聯反應而獲得的異源交聯物，所述異源交聯物包括由所述兩種異源的抗體形成的四聚體形式的異源交聯抗體，所述稀釋液可選自小牛血清或胎牛血清，優選為小牛血清，在所述質控品中，所述異源交聯物濃度為5～25μg/ml，優選20μg/ml。優選地，所述兩種異源的抗體為非人的病原體抗體和健康的未感染病原體的人抗體；優選地，所述四聚體形式的異源交聯抗體在所述異源交聯物中所占的質量比不小于50％。特別地，本專利技術提供一種替代病人TORCH病原體抗體陽性血本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種交聯抗體，其特征在于，所述的交聯抗體包括由非人的TORCH病原體抗體和健康的未感染TORCH病原體的人抗體所形成的四聚體。

【技術特征摘要】
1.一種作為病人陽性血液病原體抗體替代物的交聯抗體，其特征在于，所述的交聯抗體由小鼠anti-HSV-IMcAb和健康的未感染HSV-I的人IgG通過交聯反應所形成的四聚體形式的異源交聯抗體組成，所述交聯反應形成的連接物結構式L選自4(a)，4(a)：，所述交聯抗體的獲得方法如下所示：(1)將5mg小鼠anti-HSV-IMcAb溶解于交聯緩沖液中，攪拌加入50μlSPDP交聯劑，室溫下反應2個小時后，裝入透析袋，用還原緩沖液透析，換液四次，其中所述交聯緩沖液為0.1M磷酸鉀,0.1MNaCl,pH7.5，所述還原緩沖液為0.1M乙酸鈉,0.1MNaCl,pH4.5，所述SPDP交聯劑溶解于無水乙醇中，濃度為3.2mg/ml；(2)將5mg健康的未感染HSV-I的人IgG溶解于交聯緩沖液中，攪拌加入50μlSPDP交聯劑，室溫下反應2個小時后，裝入透析袋，用交聯緩沖液透析，換液四次；(3)在(1)中加入30μlDTT，室溫反應30分鐘后，裝入透析袋，用交聯緩沖液...

【專利技術屬性】
技術研發人員：潘劍用，周海濤，閔丹，
申請(專利權)人：英科隆生物技術杭州有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33