用于生產β-丙氨酸的工程菌及生產β-丙氨酸的方法技術

本申請公開了用于生產β-丙氨酸的工程菌及生產β-丙氨酸的方法。本發明專利技術的工程菌是在大腸桿菌基因組上的一個或多個位點整合有DNA序列的重組菌，其中所述DNA序列包含選自如下一種基因：編碼枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸α羧化酶的基因和編碼與該酶具有至少60％、優選80％、更優選90％、進一步優選95％和最優選98％、甚至99％同源性且具有所述酶活性的多肽的基因。該菌株可在不添加抗生素的情況下大量表達高活性L-天冬氨酸α羧化酶。使用上述菌株可將底物L-天冬氨酸高效轉化為β丙氨酸。解決了菌株培養過程中質粒易丟失的問題，并節省了培養菌體過程中抗生素的使用以及含抗生素廢水的后續處理，降低了工業生產的成本。

【技術實現步驟摘要】
用于生產β-丙氨酸的工程菌及生產β-丙氨酸的方法
本專利技術涉及生物催化領域，尤其涉及用于生產β-丙氨酸的基因工程菌的構建及應用。
技術介紹
β-丙氨酸是自然界天然存在的唯一一個β型丙氨酸，在醫療，食品，化工領域有廣泛的應用。如作為化工原料合成泛酸鈣、肌肽以及用于合成治療腫瘤高血鈣的帕米磷酸鈉和治療潰瘍性腸炎的費特異性抗炎藥物巴柳氮。另外，β-丙氨酸還可以作為藥劑制備中的沉淀劑、水的凈化絮凝劑、電鍍緩蝕劑、鉛中毒解毒劑以及用于合成甜味劑等。β-丙氨酸化學法生產包括丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亞胺降解法及β-氨基丙腈法。其中，丙烯腈法是國內生產β-丙氨酸的主要方法。該方法將丙烯腈和氨水氨化反應生成β-氨基丙腈，再在酸性或堿性條件下水解即得。該方法原料易得，成本較低，但有副反應，且水解過程中生成大量無機鹽，產物較難純化。近年來，通過生物轉化法來生產β-丙氨酸因其反應條件溫和、專一性強、環境友好等特點受到越來越多的關注。生物轉化法主要利用L-天冬氨酸α羧化酶特異性地脫去L-天冬氨酸的α羧基，生成β-丙氨酸。1999年，Nicole等報道了在大腸桿菌中過表達其自身來源的L-天冬氨酸α羧化酶，酶活僅為0.22U/mg，而在大腸桿菌中表達來源于谷氨酸棒狀桿菌的L-天冬氨酸α羧化酶，酶活為3.42U/mg(Nicole,1999,AppliedandEnvironmentalMicrobiology)。2002年，Chopra等發現來源于結核桿菌(M.tuberculosis)的L-天冬氨酸α羧化酶的酶活為35μmol/g·h(Chopra,2002,ProteinExpressionandPurification)。2006年，中國專利申請公開No.CN101210230A，其中公開了使用過表達其自身來源的L-天冬氨酸α羧化酶的大腸桿菌BL21(DE3)進行生物催化，最終產β-丙氨酸2.94g/L。由此可見，這些早期研究中由于所選擇的L-天冬氨酸α羧化酶活性較低，從而導致生物轉化得到的β-丙氨酸產量極低，無法達到工業化生產的需要。因此，仍需要進一步開發可用于工業化微生物催化制備β-丙氨酸的工程菌及可行的制備方法。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術通過在大腸桿菌基因組上選擇合適的整合位點，將本專利技術人之前篩選到的高酶活的、來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的L-天冬氨酸α羧化酶編碼基因整合到大腸桿菌基因組上，獲得不包含質粒的基因工程菌，經發酵培養，不僅能夠表達產生高活性的L-天冬氨酸α羧化酶，而且避免了菌體培養過程中抗生素的使用及質粒丟失情況，適于工業化微生物酶催化制備β-丙氨酸。為此，根據本專利技術，提供一種工程菌，其中所述工程菌是在大腸桿菌基因組上的一個或多個位點(例如2～4個)整合有DNA序列的重組菌，所述DNA序列包含選自編碼枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸α羧化酶的基因和編碼與所述酶具有至少60％、優選80％、更優選90％、進一步優選95％和最優選98％、甚至99％同源性且具有所述酶活性的多肽的基因中的一個。所述枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸α羧化酶優選為序列6所示的氨基酸序列。本專利技術的工程菌能夠過表達序列6所示的枯草芽孢桿菌的L-天冬氨酸α羧化酶或者過表達與所述酶具有至少60％、優選80％、更優選90％、進一步優選95％和最優選98％同源性且具有所述酶活性的多肽。根據一種實施方式，所述編碼枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸α羧化酶的基因為序列5所示的核苷酸序列。所述DNA序列進一步包含啟動子序列。對所述啟動子序列沒有特別的限制，只要能夠啟動插入的L-天冬氨酸α羧化酶編碼基因的任何啟動子都是可行的。例如但不限于：枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸α羧化酶基因自身的啟動子，構建本專利技術工程菌所用質粒中攜帶的啟動子，例如可以是PUC19中啟動子、pET-30a(+)中的啟動子，還可以是常用的強啟動子，如Lac、T7等。優選T7啟動子(序列8)。根據一種實施方式，所述整合位點是大腸桿菌基因組中的frdB基因和tktB基因中的位點。優選地，所述大腸桿菌為BL21(DE3)。根據更為具體的實施方式，通過同源重組將由四個DNA片段組成的1·2·3·4片段整合到大腸桿菌BL21(DE3)基因組中frdB基因中，其中所述1·2·3·4片段中，片段1為大腸桿菌BL21(DE3)基因組(GenBank:AM946981.2)第4287847-4287308位核苷酸的DNA片段，片段2為質粒pET30-panDB(序列7)第68-998位核苷酸的DNA片段，片段3為質粒PKD4(GenBank:AY048743.1)第31-1507位核苷酸的DNA片段，和片段4為大腸桿菌BL21(DE3)基因組(GenBank:AM946981.2)第4287127-4286588位核苷酸的DNA片段；丟掉kan抗性，獲得在frdB基因中插入一拷貝L-天冬氨酸α羧化酶基因的重組菌；和通過同源重組將由四個DNA片段組成的2-1·2-2·2-3·2-4片段整合到大腸桿菌BL21(DE3)基因組中tktB基因中，其中所述2-1·2-2·2-3·2-4片段中，片段2-1為大腸桿菌BL21(DE3)基因組(GenBank:AM946981.2)第2444239-2444839位核苷酸的DNA片段，片段2-2為質粒pET30-panDB(序列7)第236-735位核苷酸的DNA片段，片段2-3為質粒PKD4(GenBank:AY048743.1)第31-1508位核苷酸的DNA片段，和片段4為大腸桿菌BL21(DE3)基因組(GenBank:AM946981.2)第2445379-2445978位核苷酸的DNA片段；丟掉kan抗性，獲得在frdB基因和tktB基因中插入兩拷貝L-天冬氨酸α羧化酶基因的重組菌。本專利技術的工程菌用于生產β-丙氨酸。根據本專利技術的第二方面提供一種生產β-丙氨酸的方法，包括發酵培養上述工程菌的步驟。還包括以L-天冬氨酸為底物，用所述工程菌進行生物轉化，生產β-丙氨酸。本專利技術將原來在質粒上表達的L-天冬氨酸α羧化酶整合到大腸桿菌基因組中，進一步提高了培養液中L-天冬氨酸α羧化酶活性。本專利技術的工程菌不但避免了菌體在大規模培養過程中的質粒丟失問題，保證了工業化應用過程中酶活的穩定，而且該工程菌能夠正常生長和表達L-天冬氨酸α羧化酶。另外，本專利技術所構建的工程菌在菌體培養過程中無需添加抗生素，節約了培養成本和后續污水處理成本，有利于在工業上實現β-丙氨酸的生物法生產。附圖說明通過以下附圖可以更好地理解本專利技術。圖1為標準品溶液的HPLC圖譜。圖2為工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁發酵液經細胞破碎后得到的上清液的酶活柱形圖。圖3為生物轉化過程中轉化體系中生成的β-丙氨酸濃度隨時間變化的曲線圖。圖4中A為根據本專利技術的方法構建PAND-1菌株時片段FrdB-panDB-kan-FrdB的電泳圖；B為驗證構建的PAND-1-1菌株中是否帶有FrdB-panDB-kan-FrdB片段的電泳圖；C為驗證構建的PAND1菌株中已丟掉卡那霉素抗性的電泳圖。圖5中A為根據本專利技術的方法構建PAND-2菌株時片段tktB-panDB-kan-tktB的電泳圖；B為驗證構建的P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種工程菌，其中所述工程菌是在大腸桿菌基因組上的一個或多個位點整合有DNA序列的重組菌，其中所述DNA序列包含選自如下一種基因：編碼序列6所示枯草芽孢桿菌L?天冬氨酸α羧化酶的基因和編碼與該酶具有至少60％、優選80％、更優選90％、進一步優選95％和最優選98％、甚至99％同源性且具有所述酶活性的多肽的基因。

【技術特征摘要】
1.一種工程菌，其中所述工程菌是在大腸桿菌基因組上的一個或多個位點整合有DNA序列的重組菌，其中所述DNA序列為序列5所示的核苷酸序列，序列5所示的核苷酸序列編碼枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸α羧化酶。2.根據權利要求1所述的工程菌，其中整合位點是大腸桿菌基因組中的frdB基因和tktB基因中的位點。3.根據權利要求1所述的工程菌，其中所述大腸桿菌為BL21(DE3)。4.一種生產β...

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡真，張君麗，李寅，張冬竹，郭恒華，
申請(專利權)人：中國科學院微生物研究所，安徽華恒生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11