羥丙基殼聚糖取代度的測(cè)定方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種吸光光度法測(cè)羥丙基殼聚糖取代度的方法，其特征是：A.制作以吸光光度法測(cè)得的丙二醇氧化產(chǎn)物吸光度值與丙二醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B.用吸光光度值檢測(cè)待測(cè)羥丙基殼聚糖水解氧化后產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的吸光度值；根據(jù)上一步驟制作的丙二醇濃度與測(cè)得的氧化產(chǎn)物吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)羥丙基殼聚糖水解產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的含量，以此來計(jì)算羥丙基殼聚糖中所含的羥丙基含量。本發(fā)明專利技術(shù)中關(guān)鍵參數(shù)如反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，大大提高了測(cè)定的穩(wěn)定性，使顯色產(chǎn)物吸光度值的穩(wěn)定性由之前已報(bào)道的方法中不到0.5小時(shí)提高到3小時(shí)，使之更便于大批量測(cè)定，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
羥丙基殼聚糖取代度的測(cè)定方法
本專利技術(shù)涉及的是一種測(cè)定羥丙基殼聚糖取代度的方法，具體涉及用吸光光度法測(cè)定羥丙基殼聚糖取代度的方法尤其涉及其測(cè)定過程中反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。
技術(shù)介紹
殼聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、穩(wěn)定性、安全性，但其低水溶性大大限制了其在生物制藥、廢水處理、功能膜材料和紡織等領(lǐng)域的應(yīng)用。羥丙基化能改善殼聚糖的水溶性，進(jìn)而提高其在各方面的應(yīng)用。羥丙基取代度(DS)定義為每個(gè)氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖分子上連接的羥丙基的平均數(shù)量。取代度的大小決定羥丙基殼聚糖的溶解性、吸濕性、保濕型、成膜性等物化特性及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用，因此取代度的測(cè)定方法研究是羥丙基殼聚糖研究中的一項(xiàng)基本工作。目前已報(bào)道的用于羥丙基殼聚糖取代度的測(cè)定方法有吸光光度法、核磁共振氫譜法、元素分析法，其中吸光光度法成本最低，吸光光度法測(cè)羥丙基殼聚糖取代度的原理是利用羥丙基殼聚糖在濃硫酸的作用下醚鍵、N-C鍵斷裂，羥丙基基團(tuán)脫落并被氧化為丙醛或丙烯醇，兩種化合物均可與茚三酮反應(yīng)并形成紫色絡(luò)合物，通過測(cè)定此顯色產(chǎn)物的吸光度值即可定量計(jì)算羥丙基殼聚糖中羥丙基基團(tuán)的含量，此測(cè)定方法的關(guān)鍵在于顯色產(chǎn)物的生成及其吸光度值的測(cè)定。已報(bào)道文獻(xiàn)中所用的吸光光度法是直接套用羥丙基淀粉取代度的測(cè)定方法，即：將羥丙基殼聚糖與濃硫酸在100℃水浴下反應(yīng)3min，隨即將氧化產(chǎn)物置于冰水浴環(huán)境中冷卻至10℃以下，加入一定量茚三酮溶液25℃下顯色反應(yīng)100min，顯色完成后用濃硫酸定容，于590nm下測(cè)定顯色產(chǎn)物吸光光度值，同樣的操作步驟以丙二醇為底物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與羥丙基殼聚糖顯色產(chǎn)物吸光度值即可得到羥丙基取代度值。在具體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)按上述操作參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較差。首先100℃沸水浴環(huán)境不利于人工操作，且此溫度下反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)時(shí)間的變化極其敏感，反應(yīng)時(shí)間稍微延長(zhǎng)或縮短即會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)物的量(見附圖1-3)，這對(duì)操作人員在實(shí)驗(yàn)中對(duì)反應(yīng)時(shí)間的把控要求非常高，極不利于獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成重現(xiàn)性差；另外，590nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，顯色產(chǎn)物吸光度值極不穩(wěn)定，隨著檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值呈明顯的下降趨勢(shì)(見附圖4-6)，即使兩次檢測(cè)時(shí)間間隔20min，吸光度值也會(huì)發(fā)生較明顯的變化，同樣不利于獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更不利于工業(yè)大批量測(cè)定。綜上所述，現(xiàn)有的吸光光度法在準(zhǔn)確度及大規(guī)模應(yīng)用上均存在較大的問題，不利于方法的推廣與使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的為解決現(xiàn)有方法中存在的問題，提供一種利用待測(cè)羥丙基殼聚糖水解氧化后產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的吸光度值來計(jì)算羥丙基殼聚糖中所含的羥丙基含量的取代度測(cè)定方法羥丙基殼聚糖中所含的羥丙基含量。吸光光度法測(cè)定羥丙基殼聚糖取代度包括以下步驟：一種羥丙基殼聚糖取代度的測(cè)定方法，其特征是：A.制作以吸光光度法測(cè)得的丙二醇氧化產(chǎn)物吸光度值與丙二醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B.用吸光光度法檢測(cè)待測(cè)羥丙基殼聚糖水解氧化后產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的吸光度值；C.根據(jù)上一步驟制作的丙二醇濃度與測(cè)得的氧化產(chǎn)物吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)羥丙基殼聚糖水解產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的含量，以此來計(jì)算羥丙基殼聚糖中所含的羥丙基含量。優(yōu)化的，上述步驟A的具體步驟是：分別取11組具有不同濃度的丙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，濃度范圍在0-247μg/mL之間，冰水浴環(huán)境中加入0.8mL濃硫酸，混勻，于80℃水浴加熱5-8min后立即置于冰水浴冷卻，加入0.05mL茚三酮溶液，將0.75g水合茚三酮溶解于50mL12.5％的亞硫酸氫鈉水溶液中，混勻，于25℃水浴顯色100min后加入1.55mL濃硫酸，充分混勻，于波長(zhǎng)540-560nm處測(cè)定吸光度值；根據(jù)每組丙二醇濃度與測(cè)得的吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線。優(yōu)化的，上述步驟B的具體步驟是：分別取不同濃度的羥丙基殼聚糖溶液0.1mL，其濃度為0.4-1.2mg/mL，冰水浴環(huán)境中加入0.8mL濃硫酸，混勻，于70℃水浴加熱1-3min后立即置于冰水浴冷卻，加入0.05mL茚三酮溶液，混勻，于25℃水浴顯色100min后加入1.55mL濃硫酸，充分混勻，于波長(zhǎng)540-560nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)步驟A制作的丙二醇濃度與測(cè)得的氧化產(chǎn)物吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定羥丙基殼聚糖中羥丙基的含量，以此來計(jì)算羥丙基殼聚糖的取代度；羥丙基殼聚糖的取代度定義為每個(gè)氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖分子上所連接的羥丙基的平均數(shù)量。優(yōu)化的，上述丙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、羥丙基殼聚糖溶液以0.005-0.010mol/L的鹽酸溶液為溶劑。優(yōu)化的，以丙二醇為反應(yīng)物的反應(yīng)條件是80℃，6min。優(yōu)化的，上述以羥丙基殼聚糖為反應(yīng)物的反應(yīng)條件是70℃，2min。優(yōu)化的，上述測(cè)定吸光度值的最佳波長(zhǎng)范圍為550nm-555nm。優(yōu)化的，步驟C的具體方法是：將步驟B中獲得的每個(gè)樣品濃度的吸光度值代入步驟A中丙二醇濃度與顯色產(chǎn)物吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線，得到待測(cè)羥丙基殼聚糖樣品在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的含量，代入以下公式來計(jì)算羥丙基殼聚糖中所含的羥丙基含量：式中c丙二醇為樣品產(chǎn)物吸光度值所對(duì)應(yīng)的丙二醇溶液濃度，μmol/mL；V為該樣品溶液的體積，mL；m為樣品中羥丙基殼聚糖的質(zhì)量，mg；58.08、203.19、161.16分別為羥丙基基團(tuán)、N-乙酰氨基葡萄糖殘基、氨基葡萄糖殘基的摩爾質(zhì)量，g/mol；DA為羥丙基殼聚糖中每100個(gè)糖殘基中所含有的乙酰基個(gè)數(shù)；0.94為校正系數(shù)。有益效果本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)首先是優(yōu)化了反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，使反應(yīng)更溫和，更容易控制，降低了反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的影響更便于人工操作，提高了測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度；其次改變了檢測(cè)波長(zhǎng)，使顯色產(chǎn)物吸光度值穩(wěn)定性由之前方法的不到0.5小時(shí)提高到3小時(shí)，為工業(yè)大批量測(cè)定創(chuàng)造了極有利的條件。現(xiàn)詳述如下：(1)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間上的有益效果:對(duì)于反應(yīng)物為丙二醇的反應(yīng)進(jìn)程而言，如附圖7所示，在100℃反應(yīng)溫度下，其產(chǎn)物吸光度值均在反應(yīng)1-2min時(shí)達(dá)到最大值，反應(yīng)時(shí)間稍微延長(zhǎng)或者縮短均會(huì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物吸光度值造成影響，時(shí)間稍長(zhǎng)產(chǎn)物即遭到破壞，稍短則反應(yīng)不完全，因此極不利于大批量樣品的準(zhǔn)確測(cè)定，且沸水浴對(duì)于大氣壓力各異的不同地區(qū)而言很難達(dá)到相同的沸水溫度，不便于方法標(biāo)準(zhǔn)化；而80℃下丙二醇均在反應(yīng)5-6min時(shí)其產(chǎn)物吸光度值達(dá)到最大，且最大值可至少維持至8min，在反應(yīng)時(shí)間上，由于產(chǎn)物吸光度值在4-5min仍處于升高狀態(tài)，為了保證反應(yīng)完全，避免實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作中在反應(yīng)時(shí)間上可能出現(xiàn)的誤差，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為6min。而對(duì)于反應(yīng)物為羥丙基殼聚糖的反應(yīng)進(jìn)程則不同于丙二醇的情況，如附圖8所示，在反應(yīng)時(shí)間均為2min條件下，在100℃反應(yīng)所得產(chǎn)物的吸光度值明顯低于反應(yīng)溫度更低時(shí)所測(cè)得的吸光度值，這特別體現(xiàn)在高取代度樣品上，以70℃為最佳，因其隨時(shí)間變化較為平穩(wěn)，特別體現(xiàn)在1-3min之內(nèi)，如附圖9所示，為避免實(shí)驗(yàn)操作中因反應(yīng)時(shí)間上可能出現(xiàn)的誤差，反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為2min。(2)檢測(cè)波長(zhǎng)穩(wěn)定性上的有益效果：如附圖10和附圖11所示，在550nm測(cè)定，該反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值隨時(shí)間的變化比在590nm測(cè)定的吸光度值明顯平穩(wěn)許多，這為羥丙基殼聚糖的工藝研究以及大本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種羥丙基殼聚糖取代度的測(cè)定方法，其特征在于，所述測(cè)定方法的步驟為：A.制作以吸光光度法測(cè)得的丙二醇氧化產(chǎn)物吸光度值與丙二醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B.用吸光光度值檢測(cè)待測(cè)羥丙基殼聚糖水解氧化后產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的吸光度值；C.根據(jù)上一步驟制作的丙二醇濃度與測(cè)得的氧化產(chǎn)物吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定待測(cè)羥丙基殼聚糖水解產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的含量，以此來計(jì)算羥丙基殼聚糖中所含的羥丙基含量。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種羥丙基殼聚糖取代度的測(cè)定方法，其特征在于，所述測(cè)定方法的步驟為：A.制作以吸光光度法測(cè)得的丙二醇氧化產(chǎn)物吸光度值與丙二醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；所述步驟A的具體步驟是：分別取11組具有不同濃度的丙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，濃度范圍在0-247μg/mL之間，冰水浴環(huán)境中加入0.8mL濃硫酸，混勻，于80℃水浴加熱5-8min后立即置于冰水浴冷卻，加入0.05mL茚三酮溶液，將0.75g水合茚三酮溶解于50mL12.5％的亞硫酸氫鈉水溶液中，混勻，于25℃水浴顯色100min后加入1.55mL濃硫酸，充分混勻，于波長(zhǎng)540-560nm處測(cè)定吸光度值；根據(jù)每組丙二醇濃度與測(cè)得的吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線；B.用吸光光度法檢測(cè)待測(cè)羥丙基殼聚糖水解氧化后產(chǎn)生的相當(dāng)于丙二醇的吸光度值；所述步驟B的具體步驟是：分別取不同濃度的羥丙基殼聚糖溶液0.1mL，其濃度為0.4-1.2mg/mL，冰水浴環(huán)境中加入0.8mL濃硫酸，混勻，于70℃水浴加熱1-3min后立即置于冰水浴冷卻，加入0.05mL茚三酮溶液，混勻，于25℃水浴顯色100min后加入1.55mL濃硫酸，充分混勻，于波長(zhǎng)540-560nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)步驟A制作的丙二醇濃度與測(cè)得的氧化產(chǎn)物吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線確定羥丙基殼聚糖中羥丙基的含量，以此來計(jì)算羥丙基殼聚糖的取代度；羥丙基殼聚糖的取代度定義為每個(gè)氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖分子上所連接的羥丙基的平均數(shù)量；C.根據(jù)上一步驟制作的丙二...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張永勤，張坤，劉福勝，劉征東，程袁芬，吳國耀，劉均洪，戴圓圓，邊文濤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：山東;37