本發明專利技術涉及生物技術領域，公開了一種病毒特異性靶標及其應用。本發明專利技術所述乙肝病毒特異性靶標氨基酸序列為FCWEWASAK。本發明專利技術還提供所述靶標在制備治療乙型肝炎相關疾病的制劑中的應用。本發明專利技術所述靶標可實現樹突狀細胞體外的有效擴增和活化，所遞呈的T淋巴細胞對該病毒具有特異的殺傷作用，是目前最符合細胞免疫學原理的細胞免疫治療技術，具有良好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，特別涉及病毒特異性靶標及其應用。
技術介紹
病毒由一個核酸分子（DNA或RNA)與蛋白質構成或僅由蛋白質構成（如朊病毒）。 病毒個體微小，結構簡單。病毒沒有細胞結構，由于沒有實現新陳代謝所必需的基本系統， 病毒自身不能復制。但是當它接觸到宿主細胞時，便脫去蛋白質外套，它的核酸侵入宿主細 胞內，借助后者的復制系統，按照病毒基因的指令復制新的病毒。 病毒感染后，由于病毒沒有自我繁殖的能力，它必須借助人體細胞（即靶細胞）的 生長而復制。也就是說，病毒感染后必須進入人體細胞才能生存、復制。人體感染病毒致病 后，只能依靠體內免疫系統產生的免疫細胞來殺滅病毒。目前尚缺乏特效治療，仍以全身支 持療法和對癥治療為主。用抗生素或磺胺治療無效，一些抗病毒藥物如碘脫氧尿嘧啶核苷、 阿糖腺苷、無環鳥苷對皰瘆病毒感染等有一定療效。 細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的治療模式，是一種基于自身免疫的 新型治療方法，其運用生物技術和生物制劑對從病人體內采集的免疫細胞進行體外培養和 擴增后回輸到病人體內的方法，來激發/增強機體自身免疫功能，從而達到治療的目的。 細胞療法的具體方法是通過科技手段將病人體內的單個核細胞提取出來，用特殊 方法在患者體外將其培養成為樹突狀細胞OC)，賦予其專殺病毒的抗原信息，再使其數量 成千萬倍增多，成為專門攻擊殺傷病毒的"細胞導彈"。這種特殊的"導彈"能精確"瞄準" 病毒進行殺傷，卻不會傷及正常的肝細胞。然后將這種負載抗原信息的DC細胞回輸到患者 體內，在患者體內形成大量針對病毒的免疫殺傷細胞（CTL)，從而針對病毒產生主動性和靶 向性攻擊，迅速準確地殺滅病毒（包括變異病毒），使患者在短時間內康復。 目前臨床應用的細胞免疫治療技術基本停留在LAK、NK、CIK、DC(臨床腫瘤活檢組 織或腫瘤細胞系提取物）水平，而由腺病毒轉染負載抗原和CAR-T技術由于應用了基因技 術，在倫理等方面存在爭論。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種病毒特異性靶標及其在制備細胞治療制劑的應用。 本專利技術提供的病毒特異性的靶標，其氨基酸序列為FCWEWASAK，如SEQ ID No 1所 不〇 作為優選，所述病毒為乙型肝炎病毒。 本專利技術還提供所述靶標在制備治療乙型肝炎病毒相關疾病的制劑中的應用，更優 選地，所述治療為細胞免疫治療。 本專利技術的另一個目的是提供一種用于細胞免疫治療體外誘導的制劑，包含所述的 靶標。 作為優選，其為細胞培養液。更優選地，其為樹突狀細胞的細胞培養液。 本專利技術由于使用了高特異性病毒靶標，使樹突狀細胞在體外可以附載靶標并擴 增，經流式細胞儀檢測靶標附載量與樹突狀細胞擴增數量成正相關。 十余年來，專利技術人通過大量工作獲得病毒高特異性靶標，所述靶標可實現樹突狀 細胞體外的有效擴增和活化，所遞呈的T淋巴細胞對該病毒具有特異的殺傷作用，是目前 最符合細胞免疫學原理的細胞免疫治療技術，具有良好的應用前景。【附圖說明】 圖1為流式細胞儀檢測圖。【具體實施方式】 本專利技術公開了一種病毒特異性靶標及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內 容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本專利技術。本專利技術的產品及應用已經通過較佳實施 例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
技術實現思路
、精神和范圍內對本文所述的方法和 應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本專利技術技術。 為了使本領域的技術人員更好地理解本專利技術的技術方案，下面結合具體實施例對 本專利技術作進一步的詳細說明。 實施例1 : 1、標本采集 要求患者血象處于正常值范圍之內（WBC :4-10X109、LYM% :20% -40% )，上下浮 動不超過5%，機采外周血方式循環量1000-4000ml，單個核細胞數：多于1X109。抽血方式 50-100ml，單個核細胞數：多于1X10 6。 抗凝劑要求首選肝素，枸櫞酸鈉次之，禁用EDTA。 2、操作前準備 將裝有PBMC懸液的采集袋，用噴有75%酒精自上而下擦拭一遍，再放入傳入傳遞 窗，萬級層流室中的制備人員從傳遞窗中取出再用噴有75%酒精的無塵布自上而下擦拭一 遍，然后將其放入到處于運行狀態的生物安全柜中。 3、分離單個核細胞 轉移PBMC細胞懸液標本：使用經滅菌消毒的剪刀剪斷塑料管，小心地把采血袋中 的PBMC細胞懸液標本傾倒入離心管中。使用后的采血袋需用熱合機封口。 離心分離：將離心管配平，1310g，離心10min，RT。 將血漿層吸出，棄之。 稀釋：用生理鹽水按1:1比例稀釋上述細胞沉淀并吹打混勻。 鋪層加樣：將30ml稀釋的細胞懸液緩慢加入盛有室溫的15ml人淋巴細胞分離 液的50ml無菌離心管中。（方法如下：用10ml的移液管吸取細胞懸液，伸至人淋巴細胞 分離液液面上方的〇. 5cm處，讓第一滴液體延管壁緩慢自然滑落鋪至人淋巴細胞分離液液 面上，然后勾速緩慢加入細胞懸液），配平后離心750g，20min，RT (離心轉速應選擇慢升慢 降）。 提取單個核細胞：離心完畢后，離心管內出現明顯的分層，由下到上分別為：紅細 胞層、粒細胞層、Ficoll層、單個核細胞層和血漿生理鹽水層。吸取血漿層棄之，直至距白 膜層5毫米（mm)處。小心將白膜層細胞轉移至50ml無菌離心管中，補充等體積的生理鹽 水，混勻； 洗滌：750g，離心10min，RT，棄上清，用45ml生理鹽水重懸細胞，混勻。 洗滌：300g，離心10min，RT，棄上清，用45ml生理鹽水重懸細胞，混勻。（之后的生 理鹽水洗滌同此步驟） 細胞計數：吸取0. 2ml-0. 5ml細胞懸液加入到EP管中，混勻后放入細胞計數儀進 行計數. 無菌檢測留樣：再次生理鹽水洗滌，取洗滌后上清液至少5ml進行留樣，用于無菌 檢測。 4、接種細胞：根據計數結果，用GT-T551將細胞調整到IX 107個細胞/ml，接種至 T175培養瓶中，每個T175培養瓶接種30±5ml的細胞懸液，置二氧化碳培養箱37°C ;5% C02孵育30分鐘。 5、細胞培養 將孵育后的貼壁細胞作DC培養，懸浮細胞收集作為CIK培養。 DC細胞培養： 將孵育后的貼壁細胞作DC培養：取出培養瓶，輕輕搖晃十數次，使沉降于底部的 懸浮細胞浮起，并轉移至離心管中。再用生理鹽水輕輕重復洗滌幾次，直至不再有懸浮的細 胞。 DC細胞培養：貼壁細胞作DC培養，每瓶加入30ml (T175培養瓶）含特異性靶標的 DC細胞培養液（無血清完全細胞培養基（GT-T55159) 50毫升；病毒DC靶標2毫升（40-60 微克），將DC靶標2毫升用注射器吸出過0. 22微孔濾膜注入50毫升無血清完全細胞培養 基（GT-T55159)中，制備成DC培養液），置二氧化碳培養箱繼續培養，37°C ;飽和濕度；5% C02〇 貼壁細胞培養第2天（24h)，鏡下觀察細胞變形，并形成典型的樹突狀突起。 貼壁細胞培養第3天，鏡下觀察細胞，有部分細胞的樹突狀突起收縮，DC細胞趨于 成熟。用含靶標的DC細胞培養液進行半量換液（吸出10ml培養液后再補加10ml新DC培 養液），置二氧化碳培養箱繼續培養，37°C ;5% C02。 貼本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種病毒特異性的靶標，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?No?1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李彬，
申請(專利權)人：河北博海生物工程開發有限公司，
類型：發明
國別省市：河北;13
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