本發明專利技術涉及一株具有低β?半乳糖酶活性的保加利亞乳桿菌及其應用，所述的保加利亞乳桿菌分類命名為德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus?delbrueckii?subsp.bulgaricus)，微生物保藏號為CGMCC?No.9957。該菌株是從傳統乳制品中分離的保加利亞乳桿菌中篩選出的菌株，性能較為穩定，不會像突變菌株一樣因傳代次數過多導致不穩定，并且其所具有的弱后酸化能力也可一直保持，因而在實際應用中可有效延緩酸奶在儲藏期間的后酸化，延長貨架期。并且該菌株發酵特性優良，可作為弱后酸化的酸奶發酵劑用于工業化。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一株篩選得到的具有低β-半乳糖酶活性的保加利亞乳桿菌菌株，以及該菌株在發酵工業中的應用，屬于生物發酵
技術介紹
發酵乳制品中的益生菌不僅可以改善食品的品質，其自身也為人體提供改善腸道功能、促進物質吸收等有益作用。酸奶是最為普遍的一種利用乳酸菌發酵的乳制品，其主要以德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為發酵劑，在42℃下發酵至pH4.5，低溫下儲存，運輸和銷售。在發酵后和食用前的過程中，乳酸菌仍能繼續繁殖和發酵乳糖產生乳酸，使pH值進一步下降，產生人們無法接受的過酸味，同時因為酸度過高使菌體大量死亡，活菌數目較少，降低益生作用，這就是后酸化。要控制酸奶的后酸化，關鍵在于既要保持酸奶中乳酸菌的活性，又要降低乳酸菌在低溫貯存過程中的產酸能力。目前國內外對于控制酸奶后酸化的研究有很多，主要如下：(1)發酵后快速冷卻和低溫貯藏，這兩種方法已得到廣泛的認同，一定程度上解決了工廠實際生產中酸奶的后酸化問題，其中發酵后快速冷卻是為了使菌株的生長受到抑制，活力迅速下降，產酸降低，從而減緩酸奶后酸化，低溫貯藏也是同樣的道理，這是保證酸奶弱后酸化的關鍵因素之一；(2)采用超高溫殺菌和巴氏殺菌等技術，發酵成熟的酸奶，對成品進行熱處理，但殺菌后的酸奶因不含有活菌，而不符合國際乳品聯合會(IDF)制定的發酵乳制品中需含106cfu·mL-1活菌數的要求，同時《中華人民共和國行業標準》乳酸飲料中也規定：乳酸菌發酵制成的酸奶飲料中，活菌數量應達到105-106cfu·mL-1，這樣的乳酸菌制品才對人體具有生理保健功能，所以我們幾乎并不采用此方法控制酸奶制品的后酸化；(3)調整發酵劑中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的比例，適當加大酸奶發酵劑中球菌對桿菌的比例可在一定程度上延長酸奶的保質期。酸奶在發酵前期，嗜熱鏈球菌快速生長，當pH值下降到5.5左右時，保加利亞乳桿菌生長加速，嗜熱鏈球菌的生長減緩，當pH值下降到5.0左右時，此時保加利亞乳桿菌成為了酸奶發酵的主要菌株，當pH?值降至4.6左右時，由于酪蛋白的凝聚，此時凝乳開始形成，接著轉入低溫貯藏，此后主要都是保加利亞乳桿菌代謝乳糖產酸，導致pH值繼續降低，直至降到3.5左右，pH的降低增加了菌體細胞膜的通透性，影響了菌體內的pH，從而抑制了乳糖酶的活性，在介質pH為4.0-4.5時，其細胞內的pH還能維持在近中性附近，代謝酶的活力不受到影響，當介質的pH降至3.5時，菌體細胞內的新陳代謝才受到抑制。Torriani等調整了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例，認為當桿菌和球菌的比例為1：1.5時為最優的發酵條件，可很好的延長酸奶的保質期；(4)篩選低溫下產酸弱的野生菌株，控制酸乳后酸化的最好方法是選育性狀優良的保加利亞乳桿菌作為發酵劑菌株，為了克服酸奶在貯存期間的后酸化問題，Mollet和他的雀巢團隊分離并堅定了由IS調控的β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，其在乳環境中不能正常代謝乳糖產生乳酸，從而有效的降低酸奶后酸化，而Ongol也認為自然環境中存在天然的H+-ATPase缺陷型的保加利亞乳桿菌，一旦篩選出這種自發突變菌株，就可以從根本上解決酸奶的后酸化問題，這樣的菌株性狀穩定，操作上簡單，而且大大節省成本，對于降低酸乳后酸化意義重大；(5)篩選β-半乳糖苷酶活性弱的菌株，由于酸奶的后酸化主要是由于保加利亞乳桿菌在低溫貯存下繼續發酵乳糖導致酸度增加造成的，因此我們可以通過減弱保加利亞乳桿菌對乳糖的代謝強度來降低酸奶的后酸化。例如有學者通過誘變β-半乳糖苷酶基因，使該酶在40℃發酵時具有較強活性，但在貯藏期活性減弱甚至失去活性；也有學者通過令β-半乳糖苷酶基因缺失和靈氣下游基因缺失或對編碼β-半乳糖苷酶基因序列進行無意義突變的方法篩選弱后酸化突變菌株；(6)篩選H+-ATPase活性弱的菌株，國內一度熱衷于運用人工誘變育種技術生產高溫下正常產酸，低溫產酸能力受抑制的菌株作發酵劑，如車黎錳分別利用紫外誘變和化學試劑(0.9mg/mL的亞硝基胍)對保加利亞乳桿菌進行誘變處理，并通過青霉素濃縮處理，篩選出的突變株在12℃貯存過程中明顯的推遲了后酸化，但目前不能確定這個突變株是否為H+-ATPase缺陷型菌株；(7)添加外來物質控制酸奶后酸化，有學者將羧甲基纖維素(CMC)和不同穩定劑添加到酸奶制品中來提高酸奶的穩定性，使酸奶的保質期延長10d以上，也有學者通過改變乳酸菌實際所能利用的水分量，來限制菌株的產酸和生長能力，我們都知道為了保證酸奶的甜度，在鮮奶發酵前期，通常要加入少量的蔗糖、葡萄糖，由于添加了外來物質，使乳酸菌所能利用的水分活度值發生了改變，同時水分活度值的變化也影響著球菌和桿菌的比例，從而進一步降低酸奶的后酸化；(8)改變細胞膜的通透性，研究發?現，變形鏈球菌在低pH環境中生存時，細胞膜中的單不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸會增多，這樣降低細胞膜對質子的通透性，從而抑制質子進入細胞，增強耐酸性，介質的pH值對乳酸菌細胞的新陳代謝有間接影響，菌株細胞質的pH值對新陳代謝活動有直接影響，在酸奶發酵過程中由于周圍介質的pH值不斷下降，菌株的細胞膜受到侵害，通透性改變影響了菌體介質酸堿度，抑制了菌株的正常代謝，發酵成熟的酸奶，通過改變乳酸菌細胞膜通透性，使胞外的抑制物質滲透到菌體內，抑制了乳酸菌的正常生長，從而降低了后酸化的程度；(9)添加細菌素來控制酸奶后酸化，近年來，將乳酸鏈球菌素、丙酸桿菌所產的丙酸桿菌素、短桿菌分泌的短桿菌素應用到酸奶制作中，成功地抑制了酸奶的后酸化，其中詹氏桿菌素，是一種熱穩定的丙酸菌屬的細菌素，在生產過程中與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌同時添加，可抑制這兩種菌的生長和產酸，尤其是保加利亞乳桿菌，十分敏感，添加了詹氏桿菌素的酸奶可以在5℃貯存30d的情況下pH仍維持在4.15-4.42之間。雖然眾多研究者對控制酸奶后酸化的方法進行深入地探討，但這些方法中多多少少存在一些弊端：如添加防腐劑和穩定劑雖在一定程度上防止微生物污染，改善了酸奶的組織狀態，但并沒有解決酸奶酸味過重的問題，造成了生產成本增加；還有一點就是Nisin在食品中特別在固體食品中分散性不好，且是在加工后期加入，易帶來污染；誘變育種菌和基因工程菌的表達專一性和穩定性還存在隱患。Benedi等人經過研究發現，乳酸菌分解乳糖代謝為半乳糖和葡萄糖這一步驟是整個乳糖代謝的限速步驟，而β-半乳糖苷酶是酸奶在發酵結束后貯存過程中引起后酸化的關鍵酶，當β-半乳糖苷酶催化產生的乳酸還不足以抑制其活性時，保加利亞乳桿菌會繼續代謝乳糖產生乳酸，導致酸奶發生后酸化。為了解決酸奶后酸化問題，人們曾嘗試改善生產工藝和儲藏等方法，或通過基因誘變得到后酸化能力弱的突變株，但都存在著一定的弊端且無法根本解決這一問題。目前，通過改變保加利亞乳桿菌β-半乳糖苷酶的活性來控制發酵酸乳后酸化的研究已經有很多，比如令編碼β-半乳糖苷酶的基因缺失或是將編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，或是擾亂乳糖操作子的編碼序列，從而改變野生菌株中β-半乳糖苷酶活性，一定程度上減緩了后酸化水平，可見改變菌株的β-半乳糖苷酶活性可有效降低酸奶后酸化水平。目前通過改善工藝水平控制后酸化的方法很多，但都不能本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株具有低β?半乳糖酶活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus?delbrueckii?subsp.bulgaricus)菌株，其特征在于：所述具有低β?半乳糖酶活性的保加利亞乳桿菌菌株，命名為KLDS1002，微生物保藏號為CGMCC?No.9957，保藏日期為2014年11月13日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
【技術特征摘要】
1.一株具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus?delbrueckii?subsp.bulgaricus)菌株，其特征在于：所述具有低β-半乳糖酶活性的保加利亞乳桿菌菌株，命名為KLDS1002，微生物保藏號為CGMCC?No.9957，保藏日期為2014年11月13日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.根據權利要求1所述的具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，其特征在于：所述菌株的β-半乳糖酶活性與產酸能力呈正相關。
3.權利要求1或2所述的具有低β-半乳糖酶活性的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株在制備發酵乳和發酵食品中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述發酵食品為酸奶。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述菌株在42℃發酵12h時，酸奶pH值從6.36降至4.53，下降幅度明顯低于對照菌，具有弱后酸化作用。
6.根據權利要求3所述的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：霍貴成，曹鳳波，孫懿琳，李春燕，李媛媛，周晶，王曉明，劉賓，
申請(專利權)人：東北農業大學，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23
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