一種愛啡肽的制備方法技術

本發明專利技術涉及多肽藥物制備領域，尤其涉及一種愛啡肽的制備方法。該方法包括：合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin；按照愛啡肽的肽序，采用固相合成法在Fmoc-Cys（x）-Resin依次偶聯-Pro、-Trp、-Asp、-Gly、-Har、-Mpr制得愛啡肽線性樹脂，經裂解制得線性愛啡肽；取線性愛啡肽，經氧化制得愛啡肽粗品，經純化，即得。通過低溫反應使單雜含量在低于0.15%。通過液相氧化，調整pH值為7.2～7.5，既可保證氧化速率又可降低愛啡肽產品在氧化液中的溶解度，避免因大量溶解而產生的回收困難的問題。以該方法制備愛啡肽純度＞99%，其中，單雜含量＜0.15%。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及多肽藥物制備
，尤其涉及一種愛啡肽的制備方法。
技術介紹
愛啡肽，又名依非巴特、埃替非巴肽，英文名：Eptifibatide，分子式：C35H49NllO9S2，CAS登錄號為148031-34-9，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其結構為：愛啡肽為抗血小板聚集劑，由美國COR?Therapeuties公司與美國Schering-Plough公司共同研制開發。1998年7月由Schering-Plough公司以商品名Intrifiban在美國首次上市，1999年以商品名Intrifiban在歐洲上市。異名IntrifibanTM，Sch-60936，C68-22，SB-1。愛啡肽為環形肽，是血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受體拮抗劑，可阻斷由各種激活劑引起的血小板聚集反應，是已知最強的特異性血小板聚集抑制劑，主要用于防止心肌供氧動脈閉塞，心臟病發作，不穩定性心絞痛、無Q波心肌梗塞、冠脈介入治療引起的猝死。其優點在于：①對血小板糖蛋白IIb/IIIa受體的阻滯是可逆的，一旦出現不良反應可立即停藥，不良反應輕。②選擇性高，作用強。③本身幾乎無抗原性，不會引起過敏反應。臨床研究結果顯示，病人推注愛啡肽進行治療，在術后48小時，死亡或嚴重問題的聯合終點發生率（主要終點指標包括：心臟病發作、病死率及需要再次急診介入或溶栓治療率）比其他劑組減少了37%。死亡或心肌梗死發生率，愛啡肽組比其他劑組低40%。愛啡肽在急性冠脈綜合征病人中呈劑量依賴性地抑制體外血小板的聚集，在健康志愿者和做PCI術的病人中能抑制纖維原與二磷酸腺苷活化的血小板結合。對急性冠脈綜合癥病人，二磷酸腺苷誘導的血小板聚集早在本品注射后5分鐘即受到抑制，其在給藥期持續的4～8小時內恢復正常。愛啡肽180μg/kg劑量靜注和以每分鐘2μg/kg速率靜脈輸注均能達到抑制血小板聚焦80%以上，可減少患者圍手術期缺血并發癥50%～60%，而且，當肝素使用劑量合適時可不明顯增加出血事件發生率。利用枸椽酸鹽抗凝劑評價，本品抑制血小板聚焦作用較其它非鰲合型抗凝劑強2～4倍。本品可使急性冠脈綜合征病人及進行PCI術病人的出血時間延長2～4倍（與其基線值相比），在停止輸注本品后1小時內恢復正常。本品經大鼠、兔和猴的安全性評價試驗，未見毒性反應的跡象，給猴連續靜脈輸注28天，每天劑量高達7.2mg/kg也未見毒性表現。目前，愛啡肽的合成方法很多，有些采用液相合成方法，有些采用固相合成方法；有些采用片段合成的方法，有些采用逐個偶聯的方法；但現有的這些方法普遍存在著：合成步驟多、工藝復雜，難以工業化的缺點。并且在固相合成中，Cys極易產生消旋產物雜質；Gly在偶聯過程中也容易產生雙Gly雜質。因此，目前的愛啡肽產品中往往都含有大量的雜質，嚴重影響了用藥的安全性。研究表明，采用現有方法制備愛啡肽，其收率雖可達到50%以上，但產品中的單雜含量卻往往高達0.5%左右。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術要解決的技術問題在于提供一種雜質含量低而純度高的愛啡肽的制備方法。本專利技術提供的愛啡肽的制備方法，包括以下步驟：步驟1：合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin；步驟2：按照愛啡肽的肽序，采用固相合成法在Fmoc-Cys（x）-Resin依次偶聯-Pro、-Trp、-Asp、-Gly、-Har、-Mpr制得愛啡肽線性樹脂，經裂解制得線性愛啡肽；步驟3：取線性愛啡肽，經氧化制得愛啡肽粗品，經純化，即得；其中，合成的Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin中，x為Cys的側鏈保護基，合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin的溫度為-10℃～10℃；偶聯中，-Gly的偶聯反應溫度為-10℃～10℃，-Pro、-Trp、-Asp、-Har、-Mpr的偶聯反應溫度為15℃～30℃；氧化采用液相氧化，氧化液的pH值為7.0～8.0。作為優選，合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin的溫度為-5℃～5℃。D-Cys雜質與目的肽的性質非常相近，通過純化手段去除將大大損失收率，本專利技術通過低溫反應減少D-Cys雜質的產生，使其在制備的愛啡肽產品中含量低于0.15%。作為優選，-Gly的偶聯反應溫度為-5℃～5℃。現有愛啡肽制備過程中，極易產生雙甘氨酸雜質，此類雜質與目的肽的性質非常相近，通過純化手段去除將大大損失收率，本專利技術通過低溫反應減少雙甘氨酸雜質的產生，使其在制備的愛啡肽產品中含量低于0.15%。作為優選，氧化液的pH值為7.2～7.5。優選的，氧化液采用體積分數為30%的雙氧水水溶液。本專利技術通過液相氧化得到愛啡肽，液相氧化可以減少雜質產生并且減少“廢水、廢渣、廢氣”的產生。氧化液的pH值為7.2～7.5，既可以保證氧化速率又可以降低愛啡肽產品在氧化液中的溶解度，避免因大量溶解而產生的回收困難的問題。作為優選，偶聯的偶聯試劑為HOBt與DIC的混合物。作為優選，裂解的裂解液為三氟乙酸、水和三異丙基硅烷的混合物。優選的，裂解液中三氟乙酸、水和三異丙基硅烷的體積比為90:5:5。作為優選，偶聯中，-Trp采用的側鏈保護基為Boc、-Asp采用的側鏈保護基為OtBu、-Har采用的側鏈保護基為Pbf、-Mpr采用的側鏈保護基為Trt。作為優選，Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin中-Cys的側鏈保護基為Trt。作為優選，純化采用RE-HPLC。本專利技術提供的愛啡肽的制備方法，包括以下步驟：合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin；按照愛啡肽的肽序，采用固相合成法在Fmoc-Cys（x）-Resin依次偶聯-Pro、-Trp、-Asp、-Gly、-Har、-Mpr制得愛啡肽線性樹脂，經裂解制得線性愛啡肽；取線性愛啡肽，經氧化制得愛啡肽粗品，經純化，即得；其中，合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin的溫度為-10℃～10℃；偶聯中，-Gly的偶聯反應溫度為-10℃～10℃，-Pro、-Trp、-Asp、-Har、-Mpr的偶聯反應溫度為15℃～30℃；氧化采用液相氧化，氧化液的pH值為7.0～8.0。本專利技術通過低溫反應減少雙甘氨酸及D-Cys雜質的產生，使單雜含量在制備的愛啡肽產品中含量低于0.15%。通過液相氧化得到愛啡肽，液相氧化可以減少雜質產生并且減少“廢水、廢渣、廢氣”的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種愛啡肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟1：合成Fmoc?Cys（x）?Rink?amide?Resin；步驟2：按照愛啡肽的肽序，采用固相合成法在所述Fmoc?Cys(x)?Resin依次偶聯?Pro、?Trp、?Asp、?Gly、?Har、?Mpr制得愛啡肽線性樹脂，經裂解制得線性愛啡肽；步驟3：取所述線性愛啡肽，經氧化制得愛啡肽粗品，經純化，即得；其中，所述合成的Fmoc?Cys（x）?Rink?amide?Resin中，x為Cys的側鏈保護基，所述合成Fmoc?Cys（x）?Rink?amide?Resin的溫度為?10℃～10℃；所述偶聯中，?Gly的偶聯反應溫度為?10℃～10℃，?Pro、?Trp、?Asp、?Har、?Mpr的偶聯反應溫度為15℃～30℃；所述氧化采用液相氧化，氧化液的pH值為7.0～8.0。

【技術特征摘要】
1.一種愛啡肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟1：合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin；
步驟2：按照愛啡肽的肽序，采用固相合成法在所述Fmoc-Cys(x)-Resin
依次偶聯-Pro、-Trp、-Asp、-Gly、-Har、-Mpr制得愛啡肽線性樹脂，經裂解
制得線性愛啡肽；
步驟3：取所述線性愛啡肽，經氧化制得愛啡肽粗品，經純化，即得；
其中，所述合成的Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin中，x為Cys的側鏈
保護基，所述合成Fmoc-Cys（x）-Rink?amide?Resin的溫度為-10℃～10℃；
所述偶聯中，-Gly的偶聯反應溫度為-10℃～10℃，-Pro、-Trp、-Asp、-Har、
-Mpr的偶聯反應溫度為15℃～30℃；
所述氧化采用液相氧化，氧化液的pH值為7.0～8.0。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述合成...

【專利技術屬性】
技術研發人員：肖慶，劉建，馬亞平，袁建成，
申請(專利權)人：深圳翰宇藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44