本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種用于檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的試劑盒及應(yīng)用，屬于食品安全技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的試劑盒，包括內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物、探針和牛的特異性基因的引物、探針，內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物是經(jīng)過牛和羊的12SrRNA的同源性序列比對(duì)后設(shè)計(jì)得到，牛的特異性基因的引物是針對(duì)牛的12SrRNA的部分核苷酸序列設(shè)計(jì)的；本發(fā)明專利技術(shù)還提供了一種檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的方法，該方法為提取樣品的DNA，利用內(nèi)部對(duì)照和牛的特異性基因的引物和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，定量檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量。本發(fā)明專利技術(shù)方法準(zhǔn)確可靠，特異性強(qiáng)，檢出限低，具有良好的重現(xiàn)性，適用于快速定量檢測(cè)羊乳制品中牛乳的含量。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及，屬于食品安全技 術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，羊奶制品是乳制品市場(chǎng)的高端產(chǎn)品，消費(fèi)對(duì)象主要是一些高收 入的家庭。雖然羊乳及其制品價(jià)格較高，但其市場(chǎng)占有率卻一直居高不下。澳大利亞、新西 蘭是重點(diǎn)的羊奶出口國(guó)家和地區(qū)。東南亞消費(fèi)羊奶的地區(qū)主要在新加坡、馬來西亞、香港和 臺(tái)灣等地，以中國(guó)i的臺(tái)灣省羊奶消費(fèi)比較多，需求量也比較大，臺(tái)灣人普遍認(rèn)識(shí)到羊奶接 近母乳的優(yōu)勢(shì)，特別是臺(tái)灣的嬰幼兒配方羊奶粉已被廣大父母接受，據(jù)調(diào)查，在經(jīng)濟(jì)能力較 高的白領(lǐng)階層，給嬰幼兒購(gòu)買配方羊奶粉的比例達(dá)73. 3%。 我國(guó)羊奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展較晚，僅占據(jù)中國(guó)乳制品市場(chǎng)的較小份額，而且羊奶的資源相 對(duì)稀缺，主要集中在陜西、山東等地。由于羊奶產(chǎn)量的限制，不少企業(yè)無法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。 且乳山羊?qū)ι姝h(huán)境的要求高于乳牛，所以在國(guó)際市場(chǎng)上山羊乳比牛乳普遍貴2-5倍。另 外，羊乳具有極高的醫(yī)藥價(jià)值、保健價(jià)值及養(yǎng)顏養(yǎng)膚價(jià)值，所生產(chǎn)的產(chǎn)品附加值也較高，更 減少了食用羊乳的用量，因此，全球羊乳價(jià)格比牛乳高的事實(shí)很難改變。但隨著羊奶脫膻技 術(shù)的應(yīng)用和廣大消費(fèi)者對(duì)羊奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的認(rèn)同，羊乳制品有望在乳品市場(chǎng)上受到更多家庭 的歡迎。 和牛奶相比，羊奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，更容易消化，且不易引起嬰兒過敏。乳牛適宜 圈養(yǎng)，喂人工飼料，而乳山羊適宜散養(yǎng)，以吃青草和干草為主，不喂人工飼料。奶山羊是一種 以整株草（包括根）為食的動(dòng)物，在養(yǎng)殖方面會(huì)受到一定的限制，一些發(fā)達(dá)國(guó)家為了保護(hù)環(huán) 境和植被已經(jīng)開始限制奶山羊的養(yǎng)殖。每年的3-10月為奶山羊的產(chǎn)奶期，所以產(chǎn)奶量不能 與奶牛相比。這些因素勢(shì)必導(dǎo)致羊奶奶源比較稀少，價(jià)格較高。 在羊奶粉的加工工藝中，為了獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源，尤其在嬰幼兒配方粉 的加工過程中，允許添加和使用脫鹽乳清粉，這些成為羊乳制品中牛源性成分的來源，但我 國(guó)目前的羊奶粉概念模糊，對(duì)羊乳制品中的牛乳成分含量未作量化，由于牛乳價(jià)格較羊乳 便宜，一些不法分子以較高比例的牛奶粉摻入羊奶粉中來欺騙消費(fèi)者以獲取利益。 目前有關(guān)于羊乳的標(biāo)準(zhǔn)就是2007年陜西省制定的《生鮮羊乳標(biāo)準(zhǔn)》和《全脂羊乳 粉、全脂加糖羊乳粉》的地方標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)由陜西省乳品工業(yè)協(xié)會(huì)和陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢 驗(yàn)所共同提出。而在羊乳制品中的牛乳成分含量合理范圍和羊乳制品中的牛乳成分的定量 檢驗(yàn)等方面尚屬空白。 熒光定量PCR(FQ-PCR)，也稱實(shí)時(shí)熒光定量PCR，簡(jiǎn)稱熒光PCR。熒光定量PCR方法 的taqman探針法，反應(yīng)體系具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。該技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物源性成分的檢 測(cè)已有報(bào)道，我國(guó)的出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)根據(jù)該方法制定了檢測(cè)肉骨粉中牛、羊源性成分 的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但國(guó)內(nèi)在羊乳制品中的牛乳成分的定量檢驗(yàn)這方面，尚屬空白。 不同物種都具有遺傳上的獨(dú)特性，該獨(dú)特性體現(xiàn)在攜帶遺傳信息的DNA分子上。 換言之，牛與羊之所以被認(rèn)為是不同的、獨(dú)特的物種，其根本原因是牛與羊都具有自身特性 的DNA序列。所謂特異性序列是指某物種的某些DNA序列為自然界其他物種所沒有的。 羊乳制品中本身細(xì)胞含量較低，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳制品在加工過程中，DNA片段會(huì)發(fā) 生斷裂，由llOObp斷裂成600bp左右，所以當(dāng)檢測(cè)對(duì)象中的目的動(dòng)物源性成分含量很低時(shí)， 時(shí)常無法判定是否因?yàn)楣に嚨脑蛟斐蒁NA的損失而導(dǎo)致陰性結(jié)果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的試劑 盒，采用的技術(shù)方案如下： 本專利技術(shù)的目的在于提供一種用于檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的試劑盒，其特征在 于，包括內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物、探針和牛的特異性基因的引物、探針；所述內(nèi)部對(duì)照 基因的特異性引物是經(jīng)過牛和羊的12SrRNA的同源性序列比對(duì)后設(shè)計(jì)得到；所述牛的特異 性基因的引物是針對(duì)牛的12SrRNA的部分核苷酸序列設(shè)計(jì)的。 所述牛的12SrRNA的部分核苷酸序列如SEQIDNO. 7所示。 所述內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示， 探針的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；牛的特異性基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5所示，探針的核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。 -種檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的方法，其特征在于，提取樣品DNA，利用權(quán)利要求 1所述內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物及探針和牛的特異性基因的引物及探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò) 增反應(yīng)，檢測(cè)羊乳制品中牛乳的含量。 所述方法步驟如下： 1)采集牛乳對(duì)照用物質(zhì)及待檢羊乳樣品，冷凍干燥，配制含有不同牛乳含量的羊 乳樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，提取標(biāo)準(zhǔn)品和待檢羊乳樣品的DNA ; 2)以步驟1)所得標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，利用內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物和探針進(jìn)行 FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)利用牛的特異性基因的引物和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；所述內(nèi)部 對(duì)照基因的特異性引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示，探針的核苷酸序 列如SEQIDNO. 3所示； 3)以步驟1)所得待檢羊乳樣品的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述內(nèi)部對(duì)照基 因的特異性引物和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)利用權(quán)利要求1所述牛的特異性基因的 引物和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；所述牛的特異性基因的引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 和SEQ ID NO. 5所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示； 4)通過步驟3)和步驟4)的FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得標(biāo)準(zhǔn)品與待檢樣品的內(nèi)部對(duì)照 基因的ct值和牛特異性基因的Ct值，求得標(biāo)準(zhǔn)品與待檢樣品的ACt值；所述ACt值為內(nèi) 部對(duì)照基因Ct的值和牛特異性基因C的t值之差； 5)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸，以標(biāo)準(zhǔn)品的ACt值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待檢羊乳樣品中含牛乳的百分含量。 所述FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用兩步法，具體程序設(shè)定為：預(yù)變性95°C30s，1個(gè)循環(huán)； 擴(kuò)增 95°C30s，60°C35s，45 個(gè)循環(huán)。 所述FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，可以采用三步法，采用三步法時(shí)，利用內(nèi)部對(duì)照基因的特 異性引物和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)退火溫度為47-5rC，利用牛的特異性基因的引物 和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，退火溫度為49-51°C。 所述FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，內(nèi)部對(duì)照基因?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為121bp;牛特異性基 因?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為142bp。 所述方法具體步驟如下： 1)采集牛乳對(duì)照用物質(zhì)及待檢羊乳樣品，冷凍干燥，配制含有不同牛乳含量的羊 乳樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，提取標(biāo)準(zhǔn)品和待檢羊乳樣品的DNA; 2)以步驟1)所得標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，利用內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物和探針進(jìn)行 FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)利用牛的特異性基因的引物和探針進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得內(nèi)部 對(duì)照基因?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為121bp，牛特異性基因?qū)?yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為142bp;所述 FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采用兩步法，具體程序設(shè)定為：預(yù)變性95°C30s，1個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增95°C30s， 60°〇358,45個(gè)循環(huán)；所述內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物核苷酸序列如5￡〇10勵(lì).1和5￡〇10 NO. 2所示，探針的核苷酸序列如SEQID本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測(cè)羊乳制品中牛乳含量的試劑盒，其特征在于，包括內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物、探針和牛的特異性基因的引物、探針；所述內(nèi)部對(duì)照基因的特異性引物是經(jīng)過牛和羊的12SrRNA的同源性序列比對(duì)后設(shè)計(jì)得到；所述牛的特異性基因的引物是針對(duì)牛的12SrRNA的部分核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：盧雁，鄂志強(qiáng)，沙淼，劉春波，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：黑龍江;23
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